中华绒螯蟹微卫星单引物扩增产物的初步分析

采用人工合成的 6个串联重复寡聚核苷酸单引物 ,以及 2个加锚的二核苷酸引物 ,利用SPAR和ASSR技术 ,对中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)基因组进行PCR扩增 ,结果发现 ,对于GC含量丰富的三、四核苷酸引物如(CGA) 5、(GACA) 4 ,在不同退火温度的PCR反应中 ,都能扩增出清晰的条带 ,可以作为PCR扩增引物 ;反之 ,GC含量 <5 0 %的 (CATA) 4 和 (GATA) 4 很难检测到扩增产物 ;在基本PCR条件下 ,2个加锚的二核苷酸引物能扩增出可分辨的条带 ,但随着退火温度的升高 ,其中部分条带消失 ;对于不加锚的二核苷酸引物如 (AC) 8、(GA) 8,无论怎样改变退火温度 ,终难形成清晰条带。将不同引物扩增产物分别克隆到T Vector上 ,选取其中 9个阳性克隆进行序列测定 ,发现在 (GACA) 4 引物扩增的 2个片段中 ,序列结构相似 ,除引物序列外 ,都出现了 2～ 3个内部重复序列和高含量的AT ;其余

基于PCR的染色体步移中单引物扩增的克服与非特异引物的利用

基于PCR的染色体步移(PCR-Walking)方法已有许多种,包括反向PCR、连接介导的PCR、随机引物PCR等.在众多的方法中,经常存在由通用引物引起的单引物非特异扩增现象.本文综述了连接介导的PCR-Walking中单引物扩增的形成原理及克服方法.克服单引物扩增主要是使接头引物在DNA两端的接头上只有1个结合位点,从而避开单引物扩增.常用的方法有3′端加氨基修饰的不对称接头、泡泡状接头或Y字型接头及单寡核苷酸接头等方法.还介绍了2种利用通用引物非特异扩增克隆目的序列的方法:引物错配法及基于RAPD原理的单引物PCR法.

兽医领域病毒宏基因组非序列依赖性单引物扩增方法的研究现状

新一代测序技术的出现和不断完善,极大地推动了宏基因组学的发展。宏基因组学研究的路线主要包括核酸样本制备、高通量测序及生物信息学分析,而核酸样本的质量直接影响后续环节。目前有多种方法可以用于低浓度样本的扩增,其中非序列依赖性单引物扩增(SISPA)法因其经济高效性,越来越受到研究者的青睐。文章就兽医领域病毒宏基因组学研究过程中广泛使用的相关SISPA方法进行概述,包括核酸样本的预处理及扩增方案等,为相关研究提供参考。

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipa H基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44 min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16 fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3 CFU/m L;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8 CFU/m L。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr B基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。

基于非序列依赖性单引物扩增和纳米孔测序鉴别乙型流感病毒

目的采用基于非序列依赖性单引物扩增(SISPA)技术的纳米孔测序确定一起不明原因聚集性发热疫情的病原体。方法对疫情中10名患者咽拭子样本抽提核酸后,采用SISPA合成cDNA并建立纳米孔测序文库,在测序仪MinION上测序,对测序数据进行分类学分析和进化分析,最后用实时荧光定量PCR验证。并比较SISPA和随机引物反转录法的核酸富集效果。结果SISPA结合纳米孔测序技术,在8名患者样本中鉴别出乙型流感病毒核酸,检出率为80%。不同样本的乙型流感病毒序列数介于1~1618,单个基因1×覆盖度最高为99.77%。经实时荧光定量PCR验证,所有样本中均检出乙型流感病毒核酸,且Ct值与乙型流感病毒序列数呈负相关。将获得的一致性序列进行比对和进化分析,该序列与美国2022年2月报道的乙型流感病毒PB2基因序列一致性最高,达99.87%,并与美国近4年报道的乙流病毒亲缘关系较近,与我国河南、山东、江西、香港地区、台湾地区等地报道的乙流病毒同源性较低。SISPA富集扩增效果好于随机反转录法。结论SISPA结合纳米孔测序技术可用于聚集性疫情的病原学调查,在不明原因疫情处置中发挥关键作用,为疫情溯源提供参考。

可视化单引物等温扩增技术检测发酵乳制品中沙门氏菌的研究

建立了可视化单引物等温扩增技术(Visual single primer isothermal amplification,Visual SPIA)检测发酵乳制品中沙门氏菌(Salmonella)的方法。针对沙门氏菌侵袭蛋白(Invasion protein A,invA)基因设计引物,验证该方法特异性,同时对人工污染发酵乳制品的检出限进行测定。分别采用国家标准方法(GB 4789.4—2016)和可视化SPIA方法对235份发酵乳制品样品进行检测,确定可视化SPIA方法的敏感性、特异性及符合率。结果显示,12株沙门氏菌呈阳性结果,29株非沙门氏菌均呈阴性结果。荧光可视法的检出限均为3.2×10^(1) CFU/mL,沉淀可视法的检出限为3.2×10^(2) CFU/mL。可视化SPIA方法的敏感性为100.00%,特异性为98.15%,符合率为99.15%。该方法特异性强,可通过肉眼直接观察并判定结果,实现了对沙门氏菌的可视化检测,对沙门氏菌引起的食物中毒的预防和控制具有重要意义。

大豆DDRT分析中单引物造成假阳性的研究

[目的]探讨mRNA差异显示技术(DDRT)出现假阳性的原因。[方法]以大豆品种"吉林30"和"通农13"为材料,对DDRT分析中造成的假阳性进行了分析。[结果]DDRT假阳性的一个重要来源是由于单引物与cDNA组结合导致非特异性扩增造成的。在DDRT试验中,应平行设置单一引物的PCR试验以校正所得差异片段是否为假阳性或混杂有单引物PCR产物。[结论]为提高DDRT试验成功率奠定了基础。

单引物法同时克隆RDV基因组片段S11、S12及其序列分析

水稻矮缩病毒(Rice dwarf wrus,RDV)6个地方分离物基因组的lO%SDS-PAGE电泳图谱显示:松溪分离物基因片段S11、S12相对迁移速率明显不同。运用单引物法同时克隆该分离物的基因组片段S11、s12,并测定它们的全序列,结果表明s11、S12全长分别是1036bp、l066bp,基因结构和报道的RDV福州分离物基本一致,但分别突变了34、24个碱基,同源性分别为97.01%、97.86%。同时单引物法也为dsRNA病毒基因组的克隆提供了一种方法。

大豆DDRT分析中单引物造成假阳性的研究(英文)

[目的]探讨mRNA差异显示技术(DDRT)出现假阳性的原因。[方法]以大豆品种"吉林30"和"通农13"为材料,对DDR分析中造成的假阳性进行了分析。[结果]DDRT假阳性的一个重要来源是由于单引物与cDNA组结合导致非特异性扩增造成的。在DDT试验中,应平行设置单一引物的PCR试验以校正所得差异片段是否为假阳性或混杂有单引物PCR产物。[结论]为提高DDRT实验成功率奠定了基础。

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光SPIA方法的建立

以单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)hly A基因为靶序列,设计5'端为RNA序列,3'端为DNA序列的嵌合引物和链终止Blocker序列,经过优化,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence SPIA)方法,进行特异性、检出限实验,并对不同DNA提取方法进行比较。结果显示,确定荧光染料SPIA法的最佳反应温度为58℃,反应30 min,引物特异性良好,只有4株不同来源的L.monocytogenes DNA产生典型的S型荧光扩增曲线。对L.monocytogenes纯培养DNA的检出限为3.6×10~1fg/μL,相应菌液浓度为1.2×10~1CFU/m L;Realtime fluorescence SPIA检测试剂盒法、水煮法、溶菌酶-蛋白酶K法、饱和酚提取法四种方法提取DNA,均产生典型的扩增曲线,Ct值没有明显差异。对人工添加猪肉火腿样品中的L.monocytogenes,采用水煮法提取DNA的检出限为1.1×10~2CFU/g。结果表明,所建立的L.monocytogenes的Real-time fluorescence SPIA新型等温扩增方法,特异性强、灵敏度高、不受DNA纯度的影响、快速、简便。

单引物耐热链替代扩增HBV X区方法的初步探讨

目的 :以HBVX区为模型 ,对单引物耐热链替代扩增 (SDA)反应的影响因素进行初步探讨。SDA是一种等温的体外核酸扩增技术 ,其主要依据限制性内切酶识别并切割半硫酸磷酸化DNA未修饰链 (即打缺口 )以及 5′→ 3′外切酶缺陷的DNA聚合酶在切口处聚合延伸并替代下游链的特性 ,这种“打缺口—聚合 替代”不断循环往复 ,达到靶序列的扩增。方法 :以HBV为模型 ,设计一条典型的SDA引物 (含 5′悬端、BsoBⅠ酶切位点及 3′端靶序列互补区 ) ,采用耐热BsoBⅠ BstDNA聚合酶 5 3℃恒温反应体系 ,微孔板杂交检测最终产物。结果与结论 :对SDA反应的重要的影响因素进行了初步探讨 。

实时荧光单引物等温扩增技术检测牛乳中的金黄色葡萄球菌

研究建立了一种实时荧光单引物等温扩增(RF-SPIA)技术以检测牛乳中的金黄色葡萄球菌。针对金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶(nuc)基因设计引物,对金黄色葡萄球菌进行特异性检测。结果表明,6株金黄色葡萄球菌的检测结果为阳性,而其他17株非金黄色葡萄球菌的检测结果均为阴性。RF-SPIA检测金黄色葡萄球菌纯培养物的灵敏度为2.0×101 CFU/m L,检测人工污染牛乳的检出限为6.0×101 CFU/m L。该方法特异性强、灵敏度高,能够实现对金黄色葡萄球菌的实时、快速检测,为金黄色葡萄球菌的检测提供了一条新途径。

新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定

2010年4月至11月,江苏等地鸭、鹅发生了一种以产蛋率、采食量显著下降,出现脑炎样神经症状为特征的传染病。对发病鹅进行剖检观察,鸭胚尿囊腔途径接种发病鹅病料分离病原,电镜观察病毒粒子。对健康鹅接种分离病毒进行动物回归试验。在病毒核酸背景未知的情况下,应用非序列依赖性单引物扩增法结合DNA酶处理（DNase-sequence independent single primer amplification,DNase-SISPA）对病原基因进行扩增,并在此基础上设计了1对特异性引物对病毒基因进行PCR扩增。剖检结果发现病鹅的脑膜、肺脏、肝脏、心脏、卵巢等多器官出血,脾脏肿大坏死。含毒鸭胚尿囊膜超薄切片电镜观察显示：病毒粒子直径为50~60 nm。动物回归试验成功复制出该病并分离到病毒。应用DNase-SISPA方法发现了3个病毒相关基因片段,经序列比对分析,与黄病毒属（Flavi-virus）坦布苏病毒（Tembusu virus）基因序列有很高的同源性,分别为96%、88%、93%。据此设计特异性引物扩增出一段985 bp基因片段,该片段与黄病毒属坦布苏病毒E基因的核苷酸同源性为91%,氨基酸同源性为97%。将分离的鹅黄病毒毒株命名为Goose/Jiangsu/804/2010（简称JS804）。研究结果表明：此次鸭、鹅新发疫病的病原为一种新的黄病毒。

目标起始密码子多态性(SCoT):一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术

随着功能基因组学的发展,分子标记领域已开始从传统的随机或匿名性分子标记转向目的基因标记和功能性标记。目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCoT)标记是一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术,具有操作简单、重复性好等特点,根据ATG翻译起始位点侧翼保守序列来设计单引物,扩增产生偏向候选功能基因区显性多态性标记,适合不同层次实验室的不同领域的广泛应用,SCoT标记已开始在水稻和花生上得到运用。本文旨在介绍给研究者一种可以作为传统的RAPD、ISSR标记有效补充的目的基因标记新技术,希望其广泛的应用于生物多样性分析、遗传图谱构建、重要性状标记等方面。

大腹园蛛黏液蛋白ASG2 C端功能模块的克隆表达及圆二色谱分析

蜘蛛分泌的黏合物(ASG),可形成黏附性极佳的胶滴,可用于捕获猎物。其中ASG2组分被证明属于蛛丝蛋白家族,因其独特的材料学性能,ASG2具有作为新型生物材料的潜能。目前,有关ASG2末端功能区(CT)的研究非常少,阻碍了ASG2的仿生应用。为丰富ASG2 CT的基因材料,以大腹园蛛基因组DNA为模板,利用锚定PCR的方法,首次获取了大腹园蛛ASG2 CT的完整编码基因AvASG2CT,并对其进行了外源克隆表达及纯化,产量可达75 mg/L;同时利用圆二色谱对其二级结构进行分析,表明其主要构象为α-helix,这是首次对ASG2 CT的二级结构进行探索,为后续的ASG2 CT的结构和功能研究奠定基础。

单纯疱疹病毒1型引起的发热出疹性疾病需要与手足口病进行鉴别

对2008年在甘肃省发生的一起疑似手足口病(HFMD)的发热出疹性疾病的流行进行病原体的实验室检测,明确引起这起传染病流行的病原体。从4名发热出疹患者采集的8份临床标本中(每个患者采集咽拭子和疱疹液标本),首先将临床标本接种到RD和HEp-2细胞上进行病毒分离,对病毒分离阳性的标本提取病毒核酸,然后使用荧光定量-逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)进行人肠道病毒(HEV)核酸的检测。对HEV检测结果阴性的标本采用序列非依赖的单引物扩增技术(SISPA)进行"未知病原体"的鉴定。分离到的6株病毒均鉴定为单纯疱疹病毒I型(HSV-1),结合分析这起流行中患者的临床表现、流行病学调查结果以及实验室检测结果,表明HSV-1是引起这起发热出疹性疾病流行的病原体。6株HSV-1的gG区核苷酸和氨基酸水平上差异都较小,同源性分别高达98.8%和97.9%,说明这起疫情是由同一个病毒传播链引起的。HSV-1等病毒引起的发热出疹性疾病需要与HFMD进行鉴别诊断,由于仅从临床症状和流行病学资料上判断引起发热出疹性疾病的病原体是非常困难的,因此,必须依赖于实验室的诊断。

花生DNA的五种改良CTAB提取方法的比较分析及其应用

花生是世界上重要的油料作物和经济作物之一,也是最重要的植物食用油来源之一,但花生分子标记和功能基因组学等分子生物学研究较落后。因此,本研究旨在建立适合自身的花生基因组DNA的提取方法,为开展花生分子标记研究和分子生物学研究提供帮助。本研究使用了5种改良CTAB法提取花生基因组DNA,所得DNA的纯度和浓度分别通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测,再利用8种分子标记技术的48条单引物和4对转座子保守区扩增引物对提取获得的花生基因组DNA的质量进行扩增验证和应用。结果表明:(1)综合花生基因组DNA的质量检测数据以及花生分子标记技术和转座子保守区的扩增验证结果来看,五种改良CTAB法的DNA提取效果表现依次为:方法一>方法五>方法四>方法三>方法二,其中方法一为最佳首选,方法五和方法四的提取效果也好,但是由于其有利用到强腐蚀性的平衡酚,不安全且不环保,所以不推荐;(2)在花生上建立了8种分子标记技术和4类转座子保守区的扩增体系;(3)克隆获得了花生4类转座子保守区序列。本研究为今后开展花生分子标记研究及转座子的克隆鉴定利用提供了帮助。

不同样本测序前处理方案对冠状病毒基因组高通量测序结果的影响

目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份,一份直接RNA测序(未扩增),另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大,但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性,而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。