单引物耐热链替代扩增HBV X区方法的初步探讨

目的 :以HBVX区为模型 ,对单引物耐热链替代扩增 (SDA)反应的影响因素进行初步探讨。SDA是一种等温的体外核酸扩增技术 ,其主要依据限制性内切酶识别并切割半硫酸磷酸化DNA未修饰链 (即打缺口 )以及 5′→ 3′外切酶缺陷的DNA聚合酶在切口处聚合延伸并替代下游链的特性 ,这种“打缺口—聚合 替代”不断循环往复 ,达到靶序列的扩增。方法 :以HBV为模型 ,设计一条典型的SDA引物 (含 5′悬端、BsoBⅠ酶切位点及 3′端靶序列互补区 ) ,采用耐热BsoBⅠ BstDNA聚合酶 5 3℃恒温反应体系 ,微孔板杂交检测最终产物。结果与结论 :对SDA反应的重要的影响因素进行了初步探讨 。

五引物单管聚合酶链反应（PCR）扩增法快速测定人CYP2D610等位基因的类型

以人CYP2D6 10等位基因位点为研究对象,建立了一种由5条引物同时PCR扩增在单管中进行等 位基因快速检测的新方法。该方法在等位基因特异性扩增法的基础上,在内引物3′端引入了一个人工错配 碱基并在5′端附加一段“尾巴”作为引物的锚定部分,使扩增反应的特异性得到了提高。本实验所建立的方 法可在单管中同时完成SNP3种可能等位基因类型的快速检测。实测了47份样品的CYP2D6 10等位基因 的类型,并随机对其中20份样品的测定结果用RFLP法进行了验证,结果完全一致。结果表明本法简便、快 速,结果准确。

志贺氏菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立及应用

以志贺氏菌ipa H基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌的方法,反应时间为44 min。通过对4株不同群志贺氏菌和12株其他食源性致病菌进行实时荧光单引物等温扩增检测,结果表明,除4株志贺氏菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,采用普通热裂解法提取DNA,实时荧光检测福氏志贺氏菌DNA的灵敏度为1.16 fg/μL,纯培养菌液的灵敏度为1.3 CFU/m L;对牛奶模拟样品中福氏志贺氏菌的检出限是1.8 CFU/m L。研究结果表明,实时荧光单引物等温扩增检测志贺氏菌灵敏度高、特异性强、耗时短、方法简便。

副溶血性弧菌实时荧光单引物等温扩增方法的建立

以副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)gyr B基因特异序列为靶序列,设计RNA-DNA组合引物和链终止序列,优化反应体系,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence single primer isothermal amplification,实时荧光SPIA)检测副溶血性弧菌的方法。实时荧光SPIA在40 min反应时间内,对3株副溶血性弧菌和16株其他食源性致病菌进行实时荧光SPIA检测,结果表明除3株副溶血性弧菌外,其他细菌均未扩增出荧光曲线。进一步研究表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌纯培养DNA的灵敏度为8.2 fg/μL,对副溶血性弧菌菌悬液的检测灵敏度为13.5 CFU/m L;对鳕鱼、海蟹、牡蛎和咸鸭蛋等4种模拟样品中副溶血性弧菌的检出限均为14.7 CFU/g。研究结果表明,实时荧光SPIA检测副溶血性弧菌灵敏度高,特异性强,耗时短,方法简便。

中华绒螯蟹微卫星单引物扩增产物的初步分析

采用人工合成的 6个串联重复寡聚核苷酸单引物 ,以及 2个加锚的二核苷酸引物 ,利用SPAR和ASSR技术 ,对中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)基因组进行PCR扩增 ,结果发现 ,对于GC含量丰富的三、四核苷酸引物如(CGA) 5、(GACA) 4 ,在不同退火温度的PCR反应中 ,都能扩增出清晰的条带 ,可以作为PCR扩增引物 ;反之 ,GC含量 <5 0 %的 (CATA) 4 和 (GATA) 4 很难检测到扩增产物 ;在基本PCR条件下 ,2个加锚的二核苷酸引物能扩增出可分辨的条带 ,但随着退火温度的升高 ,其中部分条带消失 ;对于不加锚的二核苷酸引物如 (AC) 8、(GA) 8,无论怎样改变退火温度 ,终难形成清晰条带。将不同引物扩增产物分别克隆到T Vector上 ,选取其中 9个阳性克隆进行序列测定 ,发现在 (GACA) 4 引物扩增的 2个片段中 ,序列结构相似 ,除引物序列外 ,都出现了 2～ 3个内部重复序列和高含量的AT ;其余

兽医领域病毒宏基因组非序列依赖性单引物扩增方法的研究现状

新一代测序技术的出现和不断完善,极大地推动了宏基因组学的发展。宏基因组学研究的路线主要包括核酸样本制备、高通量测序及生物信息学分析,而核酸样本的质量直接影响后续环节。目前有多种方法可以用于低浓度样本的扩增,其中非序列依赖性单引物扩增(SISPA)法因其经济高效性,越来越受到研究者的青睐。文章就兽医领域病毒宏基因组学研究过程中广泛使用的相关SISPA方法进行概述,包括核酸样本的预处理及扩增方案等,为相关研究提供参考。

基于PCR的染色体步移中单引物扩增的克服与非特异引物的利用

基于PCR的染色体步移(PCR-Walking)方法已有许多种,包括反向PCR、连接介导的PCR、随机引物PCR等.在众多的方法中,经常存在由通用引物引起的单引物非特异扩增现象.本文综述了连接介导的PCR-Walking中单引物扩增的形成原理及克服方法.克服单引物扩增主要是使接头引物在DNA两端的接头上只有1个结合位点,从而避开单引物扩增.常用的方法有3′端加氨基修饰的不对称接头、泡泡状接头或Y字型接头及单寡核苷酸接头等方法.还介绍了2种利用通用引物非特异扩增克隆目的序列的方法:引物错配法及基于RAPD原理的单引物PCR法.

可视化单引物等温扩增技术检测发酵乳制品中沙门氏菌的研究

建立了可视化单引物等温扩增技术(Visual single primer isothermal amplification,Visual SPIA)检测发酵乳制品中沙门氏菌(Salmonella)的方法。针对沙门氏菌侵袭蛋白(Invasion protein A,invA)基因设计引物,验证该方法特异性,同时对人工污染发酵乳制品的检出限进行测定。分别采用国家标准方法(GB 4789.4—2016)和可视化SPIA方法对235份发酵乳制品样品进行检测,确定可视化SPIA方法的敏感性、特异性及符合率。结果显示,12株沙门氏菌呈阳性结果,29株非沙门氏菌均呈阴性结果。荧光可视法的检出限均为3.2×10^(1) CFU/mL,沉淀可视法的检出限为3.2×10^(2) CFU/mL。可视化SPIA方法的敏感性为100.00%,特异性为98.15%,符合率为99.15%。该方法特异性强,可通过肉眼直接观察并判定结果,实现了对沙门氏菌的可视化检测,对沙门氏菌引起的食物中毒的预防和控制具有重要意义。

单引物连接法对未知 DNA 序列的 PCR 扩增

有文章报道:将未知序列的待扩 DNA 经限制性内切酶消化,产生3′端突出的粘末端,再设计一 PCR(聚合酶链反应)引物,其3′端含有与该酶切口互补的序列,以引物作接头,用 Taq 连接酶直接将其连到待扩片段的粘端上,PCR 扩增成功。但我们试验中所用T4DNA 连接酶不能连接靠近单链区域的缺口,因而需在此设计基础上做些改进(图1):将接头(即 PCR 引物)与内切酶 Nsp I 切出的 DNA 粘端复性,用 Klenow酶填平复性后的末端,使之成为双链,这样,连接酶就可把接头与 DNA 片段间的缺口连好,末端填平时合成了与引物5′端互补的序列,这段序列正好是 PCR 反应中模板与引物的复性位置。目前已在λDNA

交叉引物扩增法检测食品中大肠杆菌不耐热肠毒素的研究

产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)可引起严重食源性疾病,建立快速、准确的检测方法对保障食品安全和人类健康具有重要意义。对ETEC不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)基因保守序列设计交叉引物等温扩增(cross priming amplification,CPA)特异性引物,同时对反应温度、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate,dNTPs)浓度、Bst-DNA聚合酶大片段浓度、Mg^(2+)浓度、甜菜碱浓度和反应时间进行优化;选取6株大肠杆菌和其他8株近源菌对CPA法进行特异性和敏感性分析;将纯培养后的产肠毒素大肠杆菌菌液稀释后随机污染46份不含LT肠毒素的生猪肉样品以评价该方法的应用效果。结果表明,CPA的最优反应温度为62℃、dNTPs浓度为0.3 mol/L、Bst聚合酶浓度为8 U/管、Mg^(2+)浓度为2.0 mmol/L、甜菜碱浓度为0.8 mol/L、反应时间为45 min;CPA方法检测产肠毒素大肠杆菌菌液的最低检出量为40 cfu/mL,为环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法的2倍,且特异性较高;46份人工污染生猪肉样品中共检测出阳性样品7份,CPA扩增结果与LAMP和荧光定量聚合酶链反应结果一致,检出率均为15.2%。

交叉引物扩增法检测食品中大肠杆菌不耐热肠毒素的探讨

CPA技术与常规PCR技术相比,既避免了对昂贵的仪器设备的依赖性,又能减少检测费用,且由于其特异性高、灵敏度高,可大幅度提高检测速度。本文基于交叉引物扩增法技术及应用,设计了使用该方法检测食品中大肠杆菌不耐热肠毒素的实验,以期能够为相关人员提供借鉴与帮助。

通用性引物RT-nPCR扩增不同基因型戊型肝炎病毒基因组的探讨

目的 :筛选戊型肝炎病毒 (HEV)通用性引物 ,用于不同基因型HEV基因组的逆转录 巢式聚合酶链扩增 (RT nPCR)。方法 :在HEV序列保守区设计和合成A、B、C、D 4组引物 ,用于扩增已知基因型的HEV参考株和HEVIgM阳性的临床标本 ,探讨扩增区域最小自由能与RT nPCR扩增效率的关系。结果 :4组引物均可扩增出不同基因型HEV基因片段 ,但得到的PCR滴度有差异 ,D组引物所得滴度最高 ,B组最低 ;5 4份临床标本的PCR阳性率也以D组最高、B组最低。D组引物扩增区段的RNA模板最小自由能的绝对值最低 ,B组的最高 ,与PCR扩增效率相关。结论 :在HEV基因组第 62 96～ 660 3核苷酸之间设计的D组通用性引物可扩增不同基因型HEV以及临床标本 ,扩增效率高 。

用三引物法提高PCR的扩增效率及特异性

聚合酶链反应(PCR)现已广泛应用于分子生物学研究的各个领域。对于模板量较低的样品及单拷贝基因,通常通过增加扩增的次数或多次PCR提高扩增的效率,但这样往往出现非特异性反应。本文采用三引物双扩增法大大提高了PCR扩增的效率及特异性。 1 材料与方法 Melanoma细胞由本室保存,能分泌人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)。RT

引物延伸预扩增用于胚胎种植前诊断的实验研究

目的 用引物延伸预扩增 (PEP)方法对种植前胚胎进行单基因病诊断的实验研究。方法 取IVF后剩余胚胎的一个卵裂球用PEP方法 ,扩增SRY、ZP3 、RhCE、RhD和FVIII 5个基因 ,而同一胚胎的另一个卵裂球双重套式PCR扩增SRY和ZP3 基因。结果 PEP分析分别由 6个胚胎获得的 6个卵裂球 ,1- 4号胚胎有 19个基因呈阳性 (19/ 2 0 ) ,1个基因阴性 ,5 ,6号胚胎除SRY均阴性 ,其余基因为阳性 ;而 6个胚胎的卵裂球双重套式PCR扩增SRY和ZP3 基因的结果与同一胚胎PEP的结果相同。结论 采用PEP方法进行种植前胚胎单基因病的诊断是可靠、准确的 ,且可用于无创性产前诊断。

应用引物延伸预扩增反应技术检测孕妇血浆中的胎儿DNA

目的 :建立一种检测孕妇血浆中胎儿DNA的新方法。方法 :对 6 5例 5～ 41孕周的孕妇血浆中胎儿DNA采用引物延伸预扩增 (PEP)后行特异性位点聚合酶链反应 (PCR)扩增 ,并用探针微孔板杂交法检测PCR产物。扩增的基因为Y染色体短臂SRY基因 ,扩增片段的大小分别为 35 1bp和 2 5 4bp。 结果 :46例妊娠男性胎儿的孕妇中 41例血浆中出现SRY基因扩增带 ,检出率 89.13 % ;19例妊娠女性胎儿的孕妇中 3例 (15 .79% )为假阳性。本研究孕早、中、晚期的性别符合率分别为 10 0 %、90 .91%、75 % ,总符合率 86 .15 %。结论 :利用PEP法能解决孕妇外周血中胎儿细胞数量太少达不到常规扩增条件所要求的最低模板量的问题 ,同时配合探针微孔板杂交法能使诊断结果更准确。

PCR方法对单细胞SRY基因扩增效率的对比研究

目的探讨单细胞基因扩增时,巢式PCR和引物预扩增(PEP)-巢式PCR两种扩增方法对SRY基因脱扣的影响程度;并应用PEP-巢式PCR方法对单个卵裂球细胞进行SRY基因诊断。方法获取单个正常男女淋巴细胞,随机分为巢式PCR组和PEP-巢式PCR组。同时扩增SRY基因和ZP3基因位点。选用IVF-ET后冻存的4个胚胎,处理后获取单个卵裂球11个,用PEP-巢式PCR扩增,鉴定其性别。结果单个淋巴细胞经巢式PCR和PEP-巢式PCR方法扩增后,其基因扩增成功率分别为92.39%,98.91%;性别诊断正确率分别为86.00%,98.00%;SRY基因的脱扣率分别为16.67%,2.38%。两者有统计学检验均有显著性差异(P<0.05。对单个卵裂球应用PEP-巢式PCR方法进行SRY基因和ZP3基因扩增后,有3个胚胎的8个卵裂球被诊断为男性,而另外1个胚胎的3个卵裂球被诊断为女性。结论1.行单细胞基因扩增时,PCR扩增方法会影响等位基因脱扣的发生率。2.对性连锁遗传病进行植入前遗传学诊断时,采用PEP-巢式PCR方法扩增SRY基因和ZP3基因对单个细胞对进行性别鉴定时,可以有效地降低SRY基因脱扣的发生率,提高性别诊断的特异性和敏感性,能够用于单细胞的性别诊断,可用于性连锁遗传病的植入前遗传学诊断。

应用PCR检测儿童恶性淋巴瘤时的引物设计及扩增条件

应用ＰＣＲ检测儿童恶性淋巴瘤时的引物设计及扩增条件步嵘综述王耀平 应大明审校近年来聚核酶联反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎｓＰＣＲ）技术已开始应用于儿童恶性淋巴瘤的基因分型诊断、恶性淋巴瘤微小残留病（Ｍｉｎｉｍａｌｒｅｓｉｄｕａｌ...

环介导等温扩增核酸技术及其应用

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。LAMP技术以其特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点在核酸的科学研究、疾病的诊断和转基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。

脊髓性肌萎缩症单细胞巢式聚合酶链反应技术的建立及初步应用

目的建立单细胞巢式聚合酶链反应技术,并探讨进行脊髓性肌萎缩症基因诊断的可行性,为植入前遗传学诊断奠定基础。方法应用显微操作技术从外周血中分离单个淋巴细胞,制备单细胞DNA模板。分别应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法扩增正常对照者外周血中单个淋巴细胞运动神经元生存(SMN)基因第7、8号外显子,计算其阳性率,建立SMN1基因的单细胞巢式聚合酶链反应技术。并应用该项技术及限制性酶切对1例脊髓性肌萎缩症患者进行基因诊断。结果正常对照者巢式聚合酶链反应共扩增60个外周血单个淋巴细胞SMN1基因第7号外显子,其中54个扩增成功,阳性率为90%;引物延伸预扩增共扩增10个外周血单个淋巴细胞,巢式聚合酶链反应分别扩增SMN1基因第7、8号外显子,在20个聚合酶链反应扩增中共有17个单个淋巴细胞扩增成功,阳性率为85%。应用巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增两种方法对1例脊髓性肌萎缩症患者单个淋巴细胞扩增后经限制性酶切显示SMN1基因缺失,结果与全血基因组聚合酶链反应-限制性酶切一致。结论巢式聚合酶链反应和引物延伸预扩增方法各有优缺点,巢式聚合酶链反应耗时短、操作简便,可作为脊髓性肌萎缩症患者单细胞基因诊断的首选方法。

单核细胞增生李斯特氏菌实时荧光SPIA方法的建立

以单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,L.monocytogenes)hly A基因为靶序列,设计5'端为RNA序列,3'端为DNA序列的嵌合引物和链终止Blocker序列,经过优化,建立实时荧光单引物等温扩增(Real-time fluorescence SPIA)方法,进行特异性、检出限实验,并对不同DNA提取方法进行比较。结果显示,确定荧光染料SPIA法的最佳反应温度为58℃,反应30 min,引物特异性良好,只有4株不同来源的L.monocytogenes DNA产生典型的S型荧光扩增曲线。对L.monocytogenes纯培养DNA的检出限为3.6×10~1fg/μL,相应菌液浓度为1.2×10~1CFU/m L;Realtime fluorescence SPIA检测试剂盒法、水煮法、溶菌酶-蛋白酶K法、饱和酚提取法四种方法提取DNA,均产生典型的扩增曲线,Ct值没有明显差异。对人工添加猪肉火腿样品中的L.monocytogenes,采用水煮法提取DNA的检出限为1.1×10~2CFU/g。结果表明,所建立的L.monocytogenes的Real-time fluorescence SPIA新型等温扩增方法,特异性强、灵敏度高、不受DNA纯度的影响、快速、简便。