应用酵母单杂交系统筛选CpG免疫激活序列的特异性结合蛋白

目的 :寻找与 Cp G免疫激活序列 (imm unostimulatory sequence,ISS)有选择性相互作用的蛋白 ,以进一步探讨其分子作用机制。 方法 :采用酵母单杂交系统 ,以 4重复的 ISS为“诱饵”,对人骨髓细胞 c DNA文库进行初步筛选 ,并对部分阳性克隆以电泳迁移率变动分析 (EMSA )进行验证。结果 :已获得 4个双阳性克隆 ,其中两个编码功能未知的蛋白 ,而另外两个均属抗体轻链 ,分别与抗 DNA抗体和抗乙肝表面抗原抗体 (HBs Ab)高度同源 ;EMSA发现 HBs Ab可在偏酸 p H条件下 (p H6 .4和 5 .8时 )特异性地与含 ISS的寡核苷酸 (Cp G- ODN)结合。 结论 :HBs Ab可与

酵母单杂交系统在植物抗渗透胁迫转录因子研究中的应用

酵母单杂交系统是由酵母双杂交系统衍生来的研究DNA与蛋白质之间相互作用的新型系统。系统阐述了单杂交系统的基本原理和技术路线,详细综述了其在植物抗渗透胁迫转录因子各个研究领域的应用进展,即克隆抗渗透胁迫类转录因子基因,确定已知DNA蛋-白质的相互作用,定位已证实的具有相互作用的DNA结合结构域以及验证转录激活作用。分析了当前该系统在植物抗渗透胁迫转录因子研究中存在的问题,进而对解决问题的途径进行了探讨。

一种快速准确构建酵母单杂交系统报道子的方法

酵母单杂交系统是根据DNA结合蛋白 (即转录因子 )与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因 ,其中构建带有不同DNA顺式作用元件的报道子是该系统的重要环节。目前 ,构建酵母单杂交系统报道子主要采用随机串联的方法 ,由于串联的顺式作用元件的个数和方向不能控制 ,所以筛选报道子费时费力。尝试采用同尾酶定向克隆的方法 ,将顺式作用元件按相同方向和所需的个数串联起来 ,减少了筛选报道子所需的时间和费用。

应用酵母单杂交系统分离水稻蜡质基因5’调控区结合蛋白的基因

在水稻蜡质基因５’上游区中一段３１ｂｐ 核苷酸序列能与水稻未成熟种子核蛋白特异结合。为了克隆这一核蛋白基因，以此３１ ｂｐ 序列构建成“鱼饵”质粒，从水稻ｃＤＮＡ文库中筛选到１３ 个阳性克隆。根据这些阳性克隆中插入ｃＤＮＡ 片段的相互杂交结果，对这些克隆进行了分组。

酵母单杂交系统分离胡萝卜生长素应答元件结合因子

高等植物胚根发育过程中,生长素是植物细胞进行分裂、延伸和分化的信号,对根的形成等起着不可缺少的促进作用.生长素应答元件（AuxRE）存在于很多生长素诱导基因的启动子中,并具有对生长素作用的应答活性.本研究构建了特定发育时期的胡萝卜体细胞胚cDNA-AD融合表达文库,同时构建了含有生长素应答元件的重组报告质粒.以生长素应答元件为诱饵,通过酵母单杂交系统筛选获得1个阳性克隆,该阳性克隆在酵母中表达的AxRF1蛋白能够在体外结合实验中与生长素应答元件结合,对AxRF1是否有可能参与胡萝卜体细胞胚中生长素诱导基因的表达调控进行了讨论.

与酵母单杂交系统匹配的植物瞬时表达分析载体的构建

为了在植物细胞/原生质体中验证酵母单杂交系统解析的植物转录因子及其关键结构域,本研究构建了一套与酵母单杂交系统相匹配的植物瞬时表达分析系统,并在拟南芥叶片原生质体中进行了瞬时表达分析。结果显示,以AtDPBF4的转录激活区(CR Ⅱ)构建的效应载体可在拟南芥原生质体中激活报告基因GUS的转录。这一结果与AtDPBF4的CR Ⅱ在酵母细胞中的结果一致。报告载体中,含有6个UASGal1的杂合启动子可引发下游报告基因GUS转录的酶活性达0.96 nmol 4-MU·mg^(-1)·min^(-1);含有3个UASGal1的杂合启动子可引发GUS基因的酶活性达0.73 nmol 4-MU·mg^(-1)·min^(-1)。含有6个UASGal1的杂合启动子的强度明显强于含有3个UASGal1的杂合启动子,但其活性并不是3个UASGal1杂合启动子的2倍,仅比其活性高了31.5%。由此表明,在报告基因中增加GAL4结合位点(UASGal1)的重复序列可以提高下游报告基因的表达,但是这种活性升高趋势并不与UASGal1的重复数量呈线性关系。

酵母双杂交系统的改进与研究进展

酵母双杂交系统是一种新兴的体内研究蛋白质之间相互作用以及筛选cDNA文库的技术手段,自建立以来得到了不断的改进与发展。在此基础上又相继出现了单杂交、三杂交、反向双杂交以及SOS富集系统等多种衍生系统,它们在功能基因组学、蛋白质组学以及药物开发研究中发挥了重要作用。本文拟就双杂交系统的原理、改进、发展及应用做一综述。

细菌单杂交方法在筛选甲基营养菌甲醇脱氢酶启动子结合蛋白中的应用

为了构建甲基营养菌转录因子亚文库及筛选与甲醇脱氢酶启动子DNA相互作用的蛋白质,对甲基营养菌MP688的基因组和转录组数据进行分析,使用关键词对全基因注释信息和转录组结果进行搜索,找到相关基因的核苷酸序列,通过PCR获得目的片段并构建一系列转录因子亚文库,利用细菌单杂交系统筛选转录因子亚文库找到与甲醇脱氢酶启动子具有相互作用的调控因子。成功构建完成含有32个转录因子的亚文库,建立了甲基营养菌中细菌单杂交筛选方法,通过该方法筛选出2个与甲醇脱氢酶启动子具有强相互作用的转录因子基因。对于基因组已测序的细菌来说,构建转录因子亚文库筛选效率要优于构建基因组文库和c DNA文库,细菌单杂交系统能成功用于甲基营养菌,并能快速高效地筛选与启动子具有相互作用的转录因子。这一方法的建立,为阐明甲醇脱氢酶在甲基菌生长和代谢产物合成中的调控机制奠定了基础。

双杂交系统的改进及其应用

自从Field和Song1989年初步建立了酵母双杂交系统以来 ,双杂交技术特别是酵母双杂交技术得到了长足的发展 ,衍生出了单杂交系统、三杂交系统、双诱饵系统等一系列相关的技术 ,使其真正成为分子生物学研究中广泛应用的技术手段 .这些技术的应用有力地推动了蛋白质与蛋白质、蛋白质与小分子多肽、蛋白质与DNA分子间相互作用的研究 .特别是在后基因组时代 ,对生命活动中蛋白质相互作用的网络信息研究 ,双杂交系统将发挥更重要的作用 .

酵母双杂交系统的应用及发展前景

酵母双杂交系统有利于检测蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA 、蛋白质与RNA和蛋白质与小分子之间的相互作用，因而对分子调控体系的研究起巨大的反 作用。文中系叙述了基于Ga14系统的双杂交技术的应用及其局限性，还介绍了单杂交系统、 双杂交系统、三杂交系统以及Sos恢复系统(SRS)。与其它领域一样，酵母双杂交系统将会在 海洋分子生物学研究中取得成功。

酵母双杂交技术的发展

自酵母双杂交系统创建以来,已经成为研究蛋白质相互作用的重要手段,被广泛用于各个生物学研究领域,揭示了大量未知蛋白质之间的相互作用。近来,在经典的酵母双杂交系统基础上,针对其局限性,相继提出许多新的研究方法,如:双(多)筛选法,SOS 富集系统,哺乳动物细胞双杂交系统,三杂交系统,单杂交系统,逆向双杂交系统,等等。本文将对上述方法进行详细叙述。酵母双杂交及其衍生系统已经成功地运用于蛋白质之间,蛋白质与 DNA、RNA、配体之间的相互作用的研究。

基于转录重建的生物大分子相互作用的研究方法

生物大分子的相互作用对生命过程有极其重要的作用。本文主要介绍了基于转录重建的生物大分子相互作用的研究方法,包括酵母双杂交系统、单杂交系统和三杂交系统等技术的共同背景,各方法的建立、原理及主要用途。