单极纺锤体1结合蛋白2基因敲除对人肝癌SMMC-7721细胞迁移的影响

目的运用规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/Cas9基因编辑技术构建敲除人单极纺锤体1结合蛋白2 (hMOB2)的肝癌SMMC-7721细胞,观察hMOB2基因敲除对其迁移的影响.方法首先将靶向hMOB2基因的导向RNA (sgRNA)的CRISPR序列克隆到慢病毒载体lentiCRISPRv2中,并将制备的慢病毒颗粒感染肝癌SMMC-7721细胞,然后使用嘌呤霉素筛选并挑取单克隆进行培养,用蛋白质印迹法(Western blot)方法检测hMOB2基因敲除效果,利用Transwell、细胞划痕迁移实验检测敲除hMOB2基因对SMMC-7721细胞迁移的影响,运用GraphPad Prism 8.0统计软件分析,计量资料以均值±标准差(Mean±SD)表示,组间比较采用t检验.结果成功构建了靶向hMOB2基因的慢病毒介导的CRISPR-Cas9编辑/敲除系统,筛选、建立了hMOB2基因稳定敲除的SMMC-7721细胞株,Transwell迁移实验显示,与对照组比较,敲除组中挑选的单克隆sgR-1细胞的迁移数为(224.3±6.3)个,sgR-2细胞的迁移数为(166.3±6.5)个,明显高于对照组[(114.3±10.5)个,t=16.680、9.714,P<0.01],细胞划痕实验结果显示,与对照组比较,sgR-1相对愈合面积为1.61±0.03(t =24.610,P<0.01),sgR-2为1.26 ±0.04(t=8.081,P<0.01).结论敲除hMOB2基因可促进人肝癌SMMC-7721细胞迁移.

单极纺锤体-结合蛋白1和蛋白激酶D1在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

目的 探究单极纺锤体-结合蛋白1(MOB1)、蛋白激酶D1(PKD1)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及临床意义。方法 选取2018年11月~2021年7月收治的100例NSCLC患者,取患者癌组织与癌旁正常组织,通过免疫组织化学染色检测MOB1和PKD1表达水平,分析MOB1和PKD1表达水平和病理特征的关系。结果 癌组织中MOB1和PKD1表达评分均低于癌旁组织(P <0.05)。受试者中MOB1表达为阳性有73例(73%),阴性27例(27%),PKD1表达为阳性有81例(81%),阴性19例(19%)。MOB1和PKD1的阳性组和阴性组年龄、性别、是否抽烟、分化程度差异均无统计学意义(P> 0.05),与NSCLCⅠ~Ⅱ期相比,Ⅲ~Ⅳ期患者MOB1和PKD1阳性表达率降低(P <0.05);与NSCLC淋巴未转移相比,淋巴转移患者MOB1和PKD1阳性表达率降低(P <0.05)。经Spearman相关性分析,MOB1和PKD1表达与TMN分期、淋巴转移呈负相关(P <0.05)。结论 MOB1和PKD1在NSCLC癌组织中的表达水平低,其在TMN分期较高和(或)淋巴转移患者中表达阳性率低,表达水平与TMN分期和淋巴转移呈负相关。

单极纺锤体蛋白激酶1是一个可能的新型抗肿瘤靶标

纺锤体装配检验点是有丝分裂分裂过程中一个非常重要的监督机器,其作用在于有丝分裂中期向后期转化前将所有的染色体排列到中期板上.近年来的研究表明,该检验点缺陷与肿瘤发生密切相关.单极纺锤体蛋白激酶1是纺锤体装配检验点的必需基因,存在于正常分裂细胞,并在肿瘤组织中高表达.最近研究发现,单极纺锤体蛋白激酶1的表达水平与乳腺癌恶性程度相关.更有意思的是抑制其激酶活性或降低其蛋白水平将会导致多种肿瘤细胞的纺锤体装配检验点功能缺陷和细胞死亡.这表明,单极纺锤体蛋白激酶1是一个潜在的抗癌药物新靶标.本文对单极纺锤体蛋白激酶1如何调控纺锤体装配检验点以及其在抗肿瘤应用研究中的最新进展进行了回顾.

单极纺锤体蛋白激酶1对骨肉瘤细胞植入裸鼠肿瘤生长的影响

目的 探讨单极纺锤体蛋白激酶1(Mps1)对骨肉瘤细胞植入裸鼠肿瘤生长的影响。方法取骨肉瘤细胞株143B,分为Mps1过表达组、空病毒载体组及空白对照组,Mps1过表达组、空病毒载体组分别转染Mps1过表达载体及空病毒载体,空白对照组不转染。取20只裸鼠,随机分为Mps1过表达组、空病毒载体组、对照组和Mps1抑制组,每组5只。Mps1过表达组、空病毒载体组裸鼠分别注射对应的转染后143B细胞,对照组和Mps1抑制组注射正常143B细胞。注射细胞7d后,Mps1抑制组裸鼠腹腔注射Mps1抑制剂,其他3组注射等量的生理盐水。观察4组裸鼠体重变化,5周后比较4组裸鼠肿瘤体积、重量、Mps1蛋白表达水平,观察瘤体组织学形态。结果给药5周后,Mps1过表达组、空病毒载体组和对照组的裸鼠出现不同程度的恶病质状态,Mps1过表达组最为严重。Mps1过表达组肿瘤体积、重量大于其他各组,Mps1抑制组瘤体体积最小,重量最轻(均P<0.05)。Mps1过表达组瘤体组织的Mps1蛋白表达水平高于其他3组,Mps1抑制组瘤体组织的Mps1蛋白表达水平低于其他3组(均P<0.05)。4组裸鼠骨肉瘤组织细胞核大,深染。结论上调Mps1的表达水平可促进骨肉瘤的生长,而抑制Mps1的表达可抑制骨肉瘤的生长。

纺锤体动粒相关复合体-1(SKA1)促进葡萄膜黑色素瘤细胞增殖的分子机制研究

目的研究纺锤体动粒相关复合体-1(SKA1)促进葡萄膜黑色素瘤(UM)细胞增殖的分子机制。方法利用SKA1敲减及空载体慢病毒感染MUM-2B细胞分别作为SKA1敲减组和对照组,再以MTT法、流式细胞术及Caspase-3/7法检测各组细胞增殖、凋亡表型的变化;利用基因表达谱芯片筛选差异基因,KEGG富集分析探寻SKA1促进UM发生发展的潜在信号通路,再以Western blot检测信号通路中关键蛋白的表达变化;利用TCGA数据库UM样本RNA测序及随访数据,分析SKA1表达与预后的关系。结果与对照组相比,SKA1敲减组细胞培养3 d、4 d、5 d的光密度均显著降低(均为P<0.01),而凋亡细胞比例及Caspase-3/7活性均显著增加(均为P<0.01)。KEGG富集分析显示,差异基因富集于P53信号通路。Western blot检测结果证实,SKA1敲减后,P53通路中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP3)的表达显著下降(P<0.05)。SKA1高表达患者总生存率下降(P=0.021,HR=2.55,95%CI0.92~7.05)。结论SKA1通过P53/IGFBP3信号通路促进UM细胞增殖,而且SKA1高表达是影响UM患者预后的危险因素。

Ran结合蛋白1表达量异常抑制小鼠卵母细胞成熟

Ran结合蛋白1(RanBP1)的时空分布和表达量对有丝分裂纺锤体的正确组装至关重要,然而RanBP1在小鼠卵母细胞成熟过程中的作用尚不清楚。本研究通过免疫荧光技术系统地分析了RanBP1在小鼠卵母细胞以及早期胚胎中的定位,并利用显微注射技术在生发泡(GV)期卵母细胞中分别注入靶向Ranbp1的Morpholino和编码Ranbp1的mRNA实现对RanBP1表达量的下调和上调,研究RanBP1对卵母细胞成熟的影响。试验结果显示在卵母细胞以及早期胚胎中RanBP1主要弥散分布在整个细胞质中,细胞核中很少。当有纺锤体形成时,RanBP1在纺锤体区域有明显的浓集。RanBP1表达量异常的卵母细胞生发泡破裂(GVBD)率降低(P<0.01),第一极体排出率降低(P<0.05)。尽管仍有高于70%的卵母细胞能够完成GVBD并成功排出第一极体,但是成熟到减数分裂Ⅱ(MⅡ)期的卵母细胞中纺锤体形态以及染色体排布异常率高于64%。纺锤体微丝减少且形态异常没有明确的规律,染色体的排布杂乱无章且出现滞后、凝集等现象,表明RanBP1表达量的异常抑制卵母细胞的成熟。该研究证实RanBP1精确的表达在小鼠卵母细胞成熟纺锤体形成以及染色体正确分裂中发挥着重要作用,为探究配子发生过程中染色体分离缺陷和克隆胚胎发育效率低的原因以及提高体细胞核移植克隆效率提供了新的依据。

非小细胞肺癌患者癌组织和血清中SKA3、G3BP2、PROX1表达与临床治疗的关系

目的探讨非小细胞肺癌患者癌组织和血清中癌基因纺锤体与着丝粒相关蛋白(SKA)3、TP酶激活蛋白SH3结合蛋白(G3BP)2和Prospero相关同源异形盒蛋白(PROX)1的表达与术后治疗的临床关系。方法选择内蒙古民族大学附属医院微创手术的非小细胞肺癌患者102例为研究对象。采用酶联免疫吸附试验检测非小细胞肺癌患者手术前后血清中SKA3、G3BP2、PROX1蛋白含量;采用免疫组织化学染色法检测非小细胞肺癌患者癌组织、癌旁组织中SKA3、G3BP2、PROX1的蛋白阳性表达强度,分析癌组织中各指标与肿瘤临床病理特征的关系。结果与术前比较,术后非小细胞肺癌患者血清中SKA3、G3BP2、PROX1的蛋白含量均明显降低(P<0.05);非小细胞肺癌患者癌组织中SKA3、G3BP2、PROX1的蛋白阳性表达强度明显高于癌旁组织(P<0.05);不同组织学分型的非小细胞肺癌患者SKA3、G3BP2、PROX1的表达差异无统计学意义(P>0.05);不同病理分型、临床分期、有无淋巴结转移的非小细胞肺癌患者SKA3、G3BP2、PROX1的表达差异有统计学意义(P<0.05)。结论非小细胞肺癌患者血清中SKA3、G3BP2、PROX1与患者临床病理特征密切相关,提示其可能成为非小细胞肺癌治疗的靶点及预测预后和复发的指标。

野生型及BRAF V600E突变型结直肠癌中磷酸化细胞外调节蛋白激酶与单极纺锤体蛋白激酶1表达及其相关性研究

目的 明确野生型（BRAF WT）及BRAF V600E突变型结直肠癌中磷酸化细胞外调节蛋白激酶（p-Erk）与单极纺锤体蛋白激酶1（Mps1）表达的相关性,以及与结直肠癌患者临床病理特征和预后的关系.方法 提取山西医科大学第一医院2009年1月至2015年6月288例结直肠癌患者肿瘤标本DNA进行Sanger测序,Kaplan-Meier法分析BRAF V600E突变与结直肠癌预后的相关性;采用免疫组织化学法检测BRAF V600E突变与BRAF WT患者中p-Erk与Mps1的表达水平;分析p-Erk与Mps1表达的相关性,以及与结直肠癌临床病理特征的关系.结果 结直肠癌患者中BRAF V600E的突变率为5.2 %（15/288）,在结直肠癌低分化腺癌中的突变率高于中高分化腺癌[14.3 %（9/63）和2.7 % （6/225）,χ^2=11.208,P=0.001],且在黏液腺癌中的突变率高于非黏液腺癌[25.0 %（6/24）和3.4 %（9/264）,χ^2=16.630,P〈0.001],p-Erk、Mps1在BRAF V600E的结直肠癌中阳性率高于BRAF WT结直肠癌患者（14/15和3/15,P〈0.05;15/15和3/15,P〈0.05）;p-Erk与Mps1表达呈正相关（R^2=0.419,P〈0.001）,且结直肠癌组织p-Erk表达阳性率在中低分化腺癌中高于高分化腺癌（χ^2=6.679,P=0.01）,在黏液腺癌中高于非黏液腺癌（χ^2=5.735,P=0.017）,在有淋巴结转移者中的表达高于无淋巴结转移者（χ^2=5.436,P=0.02）.Mps1表达阳性率在中低分化腺癌中高于高分化腺癌,差异具有统计学意义（χ^2=7.950,P=0.009）,Kaplan-Meier生存分析发现BRAF V600E比BRAF WT患者术后总体生存率低.结论 BRAF V600E可能在结直肠癌特殊病理类型中发挥重要作用,有望作为评估结直肠癌临床进展和预后的参考指标;p-Erk与Mps1的表达在结直肠癌中呈正相关,提示Mps1有可能成为结直肠癌靶向治疗新的潜在靶点.

单极纺锤体蛋白激酶1在肿瘤治疗方面的研究进展

有丝分裂检查点(SAC)是有丝分裂过程中一个极为重要的监测环节,其作用是在有丝分裂中期向后期转化之前,确保所有的姐妹染色单体排布到中期板上。最新研究显示,该检查点异常与肿瘤发生、发展与转移机制具有较高相关性。单极纺锤体蛋白激酶1 (Mps1)是一种保守双特异性蛋白激酶,其主要功能是中心体复制和激活SAC,这两个过程都有助于预防有丝分裂错误,防止肿瘤发生。最新研究结果显示,Mps1的表达水平与乳腺癌恶性程度相关,更值得注意的是抑制Mps1激酶活性或通过siRNA敲除Mps1都会导致肿瘤细胞分裂过程障碍,导致肿瘤细胞凋亡,且不会影响正常细胞的活性。细胞周期的失调与恶性肿瘤的侵袭性生物学行为亦密切相关,成为肿瘤进展的一个基本标志,细胞周期主要由若干检查点调控通路精准调控,而这些检查点特异性地在肿瘤细胞中失调并有潜力成为设计肿瘤细胞选择性治疗的靶标。本研究对Mps1如何调控SAC以及其在肿瘤治疗方面的最新进展进行综述。

单极纺锤体蛋白激酶1(Mps1)对蛋白酶体α7亚基(PSMA7)蛋白稳定性的影响

目的研究单极纺锤体蛋白激酶1(Mps1)对蛋白酶体α7亚基(PSMA7)蛋白稳定性的影响。方法通过重组PCR方法将663位天冬氨酸突变为丙氨酸,构建Mps1激酶活性缺失的突变体(pc DNA3-Flag-Mps1KD),并通过免疫印迹实验检测其是否能成功表达。采用免疫印迹实验检测Mps1及Mps1KD对PSMA7蛋白稳定性的影响;通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术检测Mps1及Mps1KD对PSMA7 RNA表达水平的影响。结果免疫印迹结果证实构建的突变质粒Mps1KD能正确表达且野生型Mps1可明显增强PSMA7稳定性,而Mps1KD则不能;加入Mps1激酶活性抑制剂后,降低PSMA7稳定性;RT-PCR检测结果发现Mps1及Mps1KD对PSMA7 RNA表达水平无影响。结论成功构建了Mps1激酶活性缺失突变体真核表达质粒pc DNA3-Flag-Mps1KD,并在293T细胞中得到了表达;研究还发现Mps1通过其激酶活性可增强PSMA7蛋白稳定性,但对其RNA表达水平无影响,为进一步研究Mps1对蛋白酶体功能影响及对肿瘤发生发展奠定基础。

单极纺锤体蛋白激酶1(Mps1)与蛋白酶体α7亚基(PSMA7)相互作用研究

目的研究单极纺锤体蛋白激酶1(Mps1)与蛋白酶体α7亚基(PSMA7)是否存在蛋白间相互作用。方法以真核表达质粒p CMV-C-Myc-PSMA7为模板,p GEX-4T-1为载体,构建原核表达载体p GEX-4T-1-PSMA7(GSTPSMA7);并通过GST pull-down及免疫共沉淀实验检测Mps1与PSMA7之间是否存在相互作用。结果免疫印迹实验结果证实,构建的原核表达载体p GEX-4T-1-PSMA7(GST-PSMA7)能正确表达;GST pull-down及免疫共沉淀实验表明,Mps1与PSMA7之间存在蛋白质间相互作用。结论成功构建了原核表达载体p GEX-4T-1-PSMA7(GSTPSMA7),并在大肠杆菌中得到了表达;Mps1与PSMA7之间存在相互作用,为进一步研究两者之间的关系及Mps1功能的影响打下基础。

MOB2敲低表达调控NDR1/2-YAP对肝癌细胞迁移和细胞自噬的研究

以肝癌细胞SMMC-7721和SK-HEP1为研究对象,构建慢病毒介导的单极纺锤体1结合蛋白2 (MOB2)稳定干扰表达的细胞模型;应用RT-qPCR和Western blotting方法检测相关基因的表达水平;利用Transwell细胞迁移试验和自噬流试验检测MOB2敲低表达对细胞迁移和细胞自噬的影响。结果表明:MOB2敲低表达可抑制肝癌细胞SMMC-7721和SK-HEP1的迁移,促进细胞自噬;MOB2敲低表达可上调NDR1/2的磷酸化水平(pT444/442)和YAP的磷酸化水平(pS127YAP),下调受YAP转录调控的下游靶基因CTGF和CYR61的表达;MOB2敲低表达可上调ULK1、LC3BII,下调SQSTM1/p62,促进细胞自噬流的形成。这一研究说明MOB2敲低表达可通过促进NDR1/2的磷酸化而负调控YAP的转录激活活性,调控下游与细胞迁移和自噬相关基因的表达,影响肝癌细胞的迁移和细胞自噬过程。

MOB1表达水平与非小细胞肺癌切除术后疾病进展风险的相关性

目的探讨单极纺锤体-结合蛋白1(MOB1)表达水平与非小细胞肺癌(NSCLC)切除术后疾病进展风险的相关性。方法选择2018年1月至2019年9月于我院就诊的85例NSCLC患者。收集患者临床资料,影像学资料,病理学资料及MOB1表达水平;两组患者均行NSCLC切除术,术后随访1年,根据患者疾病进展情况分为进展组和非进展组。分析MOB1表达水平与NSCLC切除术后疾病进展风险的相关性。结果随访1年,截至末次随访,共有12例患者因不同原因失访,最终纳入73例NSCLC切除术后患者,其中26例患者出现疾病进展为进展组,47例未出现疾病进展定义为无进展组。进展组T4分期、淋巴转移比例高于未进展组(P<0.05),MOB1表达水平、MLD E/I、VI-850/-950E-I低于未进展组(P<0.05),多因素Logistic回归分析显示淋巴转移(OR=2.570)、T分期(OR=2.096)、MOB1(OR=4.931)是NSCLC癌切除术后疾病进展风险的独立影响因素,ROC曲线分析显示,MOB1 AUC为0.835。结论MOB1表达水平在NSCLC疾病进展患者中低表达。