单核增生李斯特氏菌适体的筛选与结构分析

为获得与单核增生李斯特氏菌特异性结合的适体,对体外合成长度为78个碱基的随机ssDNA文库,采用SELEX技术,以单核增生李斯特氏菌为靶标进行10轮筛选。将筛选到的适体群进行克隆、测序,用Macaw2.05和DNAMAN软件对每一适体的保守序列和二级结构进行分析。一级结构分析获得6个保守序列:TTTTTTT、TGCTCTT、CGGGGGT、GTTTTT、XTGTT、XTTGT,其中2号和12号、7号和9号、158、159和160号适体序列完全一致。二级结构分析表明,茎环状和口袋状等结构可能是适体与单核增生李斯特氏菌结合的结构基础,其一级和二级结构与亲和力密切相关。

单核增生李斯特氏菌的分布研究

对采自人和动物粪便、冷链食品、猪肉、羊肉、牛肉、鸡肉、鱼肉等640份样品进行李斯氏菌的分离与鉴定,研究了李斯特氏菌的分布状况,检出单核增生李斯特氏菌1株,英诺克李斯特氏菌7株,威尔斯李斯特氏菌1株,格氏李斯特氏菌34株,默氏李斯特氏菌6株;单核增生李斯特氏菌的检出率为0.16%,李斯特氏菌的总检出率为7.66%。

食品中单核增生李斯特氏菌检测研究进展

单核增生李斯特氏菌和李斯特菌病的危害近年来引起世界各国食品和卫生部门的广泛关注。关于如何找到一种快速、敏感、准确、合理的检验方法 ,是当今各国食品卫生部门亟待解决的重要研究课题。对该菌的传统分离方法、免疫学检测方法、核酸检测等方法的最新进展进行了综述 ,为进行该菌的准确、快速检测奠定了基础。

MPCR检测食品中大肠杆菌O157和单核增生李斯特氏菌的研究

根据大肠杆菌O157(Escherichia coliO157,E.coliO157)的志贺样毒素基因slt和"黏附抹平"因子eaeA基因、单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytohenes,LM)的编码溶血素O的hlyA基因和毒力基因plcA,分别设计上游和下游的slt、eaeA、hlyA和plcA四对引物,对应扩增片段依次为780、450、708、600bp。通过对单管多重PCR(multiplex PCR,MPCR)扩增的特异性、敏感性分析以及对单管多重PCR扩增条件,如Mg2+浓度、dNTPs浓度和退火温度等的优化,建立快速检测大肠杆菌O157和单增李斯特菌的多重PCR方法,该方法能同时检测到0.50ng的E.coliO157和单增李斯特菌基因组DNA,并且操作简便、快速,具有良好的敏感性和特异性,能够快速实现对食品中多种致病菌的诊断和监控。

单核增生李斯特氏菌生物被膜的形成及控制

研究温度、接种量对单核增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)生物被膜形成的影响和肉制品加工企业中常用的消毒方法对单增李斯特氏菌生物被膜的去除及抑制作用。研究结果表明,单核增生李斯特氏菌标准菌株生物被膜的形成主要受到温度的影响,接种量对生物被膜形成的影响只在特定的温度范围内显著。以不同的常规消毒方法对模拟生产车间条件培养生长1d的单增李斯特氏菌生物被膜进行处理,结果发现不同方法对生物被膜去除效果的差异性随着处理天数的增加而增加,且各方法对生物被膜的去除作用与抑制作用无关。

平板计数法检测肉制品中单核增生李斯特氏菌的不确定度分析与评定

建立平板计数法测定单核增生李斯特氏菌的不确定度评定方法,在具体检测中提高科学性和准确性。实验分析得出,检测过程中引入的不确定度分量来源分别为样品称量、稀释、加样、重复实验,利用统计学方法计算各不确定度分量、合成不确定度及拓展不确定度。在95%置信水平下,单增李斯特氏菌含量对数的扩展不确定度为0.115 0,重复试验对不确定度结果贡献较大。

单核增生李斯特氏菌近红外快检方法建立与应用

目的建立一种近红外荧光免疫法快速检测单增李斯特氏菌的方法。方法采用近红外荧光染料Dylight800标记单增李斯特菌单克隆抗体,结合免疫侧向流技术制备单增李斯特菌快速检测试纸条。结果整个实验过程仅需45 min,对食品中单增李斯特氏菌最低检测限为500 CFU/mL,与其他5种食源性致病菌均无交叉反应。特异性为89.47%,敏感性为100%。采用近红外荧光免疫层析法和传统方法对30份食品进行检测,结果发现2种方法符合性达93.3%。结论所研制的单增李斯特菌的近红外快检试纸条具有特异性、敏感性较高的特点,适用于食品样本中单增李斯特菌的即时检测。

益智精油化学成分分析及其对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌机理

以姜科植物益智果实为原料,采用水蒸气蒸馏法提取其精油,采用气相色谱-质谱联用技术分析益智精油的化学成分;通过滤纸片法和微量对倍稀释法分别测定益智精油对单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的抑菌圈、最低抑菌质量浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)及最低杀菌质量浓度(minimum bactericidal concentration,MBC),评价其抑菌活性,利用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察益智精油对菌体微观形态的影响,并通过测定菌体的生长曲线、电导率变化、大分子物质泄漏、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase,SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量探究益智精油对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌机理。结果表明:从益智精油中共鉴定出45种化合物,以萜烯类、芳香烃及萜类含氧衍生物为主,其中巴伦西亚橘烯、圆柚酮、2,6,10,10-四甲基双环[7.2.0]十一烷-1,6-辛二烯、(2S,4aR,8aR)-4a,8-二甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氢萘、(2R,8R,8aS)-8,8a-二甲基-2-(丙-1-烯-2-基)-1,2,3,7,8,8a-六氢萘和对伞花烃为相对含量较高的化合物;此外,益智精油可显著抑制单核细胞增生李斯特氏菌活性,其抑菌圈直径为14.20 mm,MIC和MBC分别为0.195、0.781 mg/mL,生长曲线测定发现,益智精油抑菌活性呈浓度依赖性;扫描电子显微镜和透射电子显微镜显示益智精油可破坏单核细胞增生李斯特氏菌细胞形态结构,改变菌体细胞膜的通透性,造成细胞内大量电解质、大分子内容物(核酸和蛋白质)泄漏,破坏菌体内SOD系统原有的动态平衡状态,导致SOD活力变化,同时诱导大量自由基生成,导致菌体细胞内脂质氧化程度升高,使MDA含量增加。综上,益智精油作用于单核细胞增生李斯特氏菌导致菌体细胞一系列变化,从而抑制菌体的生长并导致其凋亡,是益智精油中多种成分、多靶点协同作用的结果,初步分析萜烯类、芳香烃类和酮类物质是其抑菌的主要有效成分,为益智作为食品行业天然抑菌剂的开发利用提供了科学理论依据。

单核细胞增生李斯特氏菌微量生化鉴定试剂盒应用效果研究

目的:评价本实验室研制的一步加样单核细胞增生李斯特氏菌微量生化鉴定试剂盒(简称EasyID)的可靠性和便捷性。方法:采用39株测试菌(目标菌25株和非目标菌14株),对EasyID和其他两个厂家同种生化鉴定试剂盒(以下简称GS1、GS2)及传统管状生化鉴定套盒(以下简称CTG)进行测试,以GB4789.30-2016中提供的标准生化反应为参考。结果:在同等条件下,25株目标菌单核细胞增生李斯特氏菌在EasyID和GS1培养24 h,各项生化反应结果与标准反应符合率均为100%,但GS2和CTG需延长培养至48 h各项生化反应结果与标准反应符合率才达到100%;14株非目标在EasyID和GS1培养24 h,各项生化反应结果与标准反应符合率均为100%,但GS1、GS2和CTG需延长至48 h各项生化反应结果与标准反应符合率才达到100%。结论:EasyID操作便捷、反应速度和准确性优于GS1、GS2和CTG,因而可替代传统管状生化鉴定套盒应用于食源性致病菌单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定中。

2022—2023年贵州省单核细胞增生李斯特氏菌PFGE分型及耐药性分析

目的了解2022—2023年贵州省单核细胞增生李斯特氏菌血清表型、脉冲场凝胶电泳(pulse-field gel electrophoresis,PFGE)分子分型特征和耐药情况,旨在为贵州省李斯特氏菌病的防控提供实验室数据支持并提高预警监测能力。方法收集2022年1月—2023年12月贵州省致病菌识别网中心实验室监测腹泻疾病相关样本1220份,按照GB 4789.30—2016《食品安全国家标准食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验》的执行标准分别进行分离培养,按照《国家致病菌识别网实验室监测技术手册(2022试用版)》进行实时荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法鉴定,多重PCR检测血清型分型、PFGE分子分型和药敏试验。结果1220份腹泻疾病相关样本分离出424株菌株,其中单核细胞增生李斯特氏菌11株,阳性率为2.59%(11/424);11株单核细胞增生李斯特氏菌分为6种血清表型,血清型分布为1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b和3c型;11株单核细胞增生李斯特氏菌对头孢西丁(cefoxitin,FOX)耐药率高达100%,对氯霉素(chloroamphenicol,CHL)中介率为72.72%,剩余12种药物[红霉素(erythromycin,ERY)、复方新诺明(trime-thoprim/sulfamethoxazole,T/SUL)、庆大霉素(gentamicin,GEN)、亚胺培南(imipenem,IPM)、苯唑西林(benzoxacillin,OXA)、克林霉素(clindamycin,CLI)、环丙沙星(ciprofloxacine,CIP)、达托霉素(datomycin,DAP)、氨苄西林(ampicillin,AMP)、四环素(tetracycline,TET)、万古霉素(vancomycin,VAN)、青霉素(chloramphenical,PEN)]均100%敏感;经AscⅠ酶切后11株单核细胞增生李斯特氏菌分成7种PFGE带型,相似性为40%~100%,其中3株菌相似性高达100%。结论2022—2023年贵州省发生了一起家庭聚集性李斯特氏菌病事件,遵义市肉制品中存在相同的污染来源,且污染源持续存在,贵州省具有多种致病性单核细胞增生李斯特氏菌,但尚未出现严重耐药情况。

植物乳杆菌对猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌抑制模型的建立

人类患李斯特菌病的概率和食品中单核细胞增生李斯特氏菌的最大污染浓度(Nmax)紧密相关。益生菌作为生物保护菌应用在食品中控制单核细胞增生李斯特氏菌的生长已得到广泛应用,在复杂的食品环境中,益生菌对单核细胞增生李斯特氏菌生长特性的影响可通过细菌间的竞争抑制模型来描述。本研究首先确认益生菌植物乳杆菌植物亚种CICC6257(以下简称为植物乳杆菌CICC6257)在猪肉中的生长能力,探究该菌对猪肉品质的影响,然后对选择性培养基的菌落计数能力进行验证,最后基于预测微生物学方法研究植物乳杆菌CICC6257对猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌生长特性的影响。结果表明:植物乳杆菌CICC6257在13℃贮藏的猪肉中生长良好,60h左右生长达到稳定期,并且在货架期内对猪肉的pH值无显著影响(P≥0.05);选择性培养基可以很好地对单核细胞增生李斯特氏菌和植物乳杆菌CICC6257进行分离计数;Jameson-effect模型能够准确描述植物乳杆菌CICC6257对单核细胞增生李斯特氏菌的抑制作用;植物乳杆菌CICC6257对单核细胞增生李斯特氏菌的迟滞时间(λ)和最大比生长速率(μmax)无显著影响(P≥0.05),但可将猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌的Nmax显著降低0.75(lg(CFU/g))(P<0.05)。

益生菌防控单核细胞增生李斯特氏菌生物膜形成的机制及应用研究进展

单核细胞增生李斯特氏菌是一种具有高度环境适应性的食源性致病菌,生物膜的形成是导致其在食品工业中持久性存留、食品污染和疾病传播的重要原因。益生菌作为一种有益宿主健康的微生物,同时也对单核细胞增生李斯特氏菌有较强的抑制和清除作用,逐渐被开发为一种生物保护策略应用于单核细胞增生李斯特氏菌生物膜的防控。然而,由于单核细胞增生李斯特氏菌生物膜形成受多种因素调控,这种基于益生菌的生物保护策略应用及抑制生物膜机理尚未得到完全阐明,缺乏全面、系统的总结。因此,本文基于单核细胞增生李斯特氏菌的群体感应、泳动能力、疏水性、自聚集性、胞外聚合物生成等生物膜形成途径,详细总结益生菌保护策略在不同加工表面防控单核细胞增生李斯特氏菌生物膜的研究现状。同时,对单核细胞增生李斯特氏菌在肉品工业中的持久性存留和生物膜向肉品转移问题,以及相对应的生物抑菌策略进行讨论。最后,针对益生菌防控单核细胞增生李斯特氏菌生物膜过程中可能存在的细菌信号交流机制做出展望,以期为在食品工业中设计更安全、有效的生物防护策略提供理论依据和参考。

食品标准与法规中研讨式教学法应用研究——以“单核细胞增生李斯特氏菌检测标准”为例

根据《食品标准与法规》课程特点及其重要应用价值,为满足我校应用型大学可持续发展,培养食品质量 与安全专业学生解决问题的实际能力,本文将中国食品安全国家标准-食品微生物学检验-单核细胞增生李斯特氏菌 检验-GB4789.30-2016与美国食品与药品监督管理局的Bacteriological Analytical Manual BAM-Chapter10: Detection of Listeria monocytogenes in Foods and Environmental Samples, and Enumeration of Listeria monocytogenes in Foods(2022)进行了系统比对。采用研讨式教学法进行分组讨论中美两国食品安全标准差异,同 时辅以中英双语教学模式进行深入推广,采用课前专业知识提前发放进行有效预习,课程讲授中进行比例适当的中英双 语教学,既能加深专业知识学习同时还能有效提高相关专业英语能力的应用,从而提高学生对于中美两国食品安全标准 特点的掌握与执行能力,为学生今后从事与食品安全标准领域专业工作打下良好基础,提升课堂教学质量。

食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法应用分析

目的:对熟肉制品、速冻调理肉、速冻水产制品、即食果蔬制品、冷冻饮品和乳制品6类食品开展单核细胞增生李斯特氏菌检测,总结试验注意事项,评估病原菌污染风险,为食品质量监控提供依据。方法:依据国家标准对样品进行增菌、分离、初筛、鉴定,计算检出率。结果:速冻调理肉、速冻水产制品、冷冻饮品3类食品均检出单核细胞增生李斯特氏菌,其中冷冻饮品检出率最高。结论:冷冻食品有单核细胞增生李斯特氏菌污染风险;选择合适的检测方法监控病原菌,可降低单核细胞增生李斯特氏菌食品污染发生概率,保障食品安全。

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验能力验证结果分析

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM),简称为单增李斯特氏菌,是一种需氧兼性厌氧的食源性病原菌、革兰氏阳性短杆菌,广泛存在于自然界中。其中,奶制品、肉制品、水产品、海产品、禽类食品、蔬菜等容易受到该菌污染,误食用含有该菌的新生儿、老年人等免疫力低者易患脑膜炎、败血症,孕妇则易发生早产或流产,致死率高达20%-30%,给食品安全造成严重威胁。

乳粉中沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌检验能力验证结果和关键控制点分析

为了有效验证实验室对沙门氏菌和单核细胞增生李斯特氏菌的检验检测能力,保证日常检验检测结果的准确性,本实验室参加了中国检验检疫科学研究院组织的PT1368乳粉中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌的能力验证计划。采用传统生物学培养及普通生化鉴定的方法,同时运用荧光定量PCR仪对试验结果进行验证,并分析总结检测结果和关键影响因素,2个样品均检出沙门氏菌,2个样品均检出单增李斯特菌,与组织单位结果一致,最终获得满意的结果。

TaqMan实时荧光PCR快速检测与鉴定单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品

利用TaqMan实时荧光PCR技术对单核细胞增生李斯特氏菌能力验证样品进行快速鉴定和验证。依据GB 4789系列标准的第一法对ACAS-PT526能力验证中的样品D15和样品D16进行检测,通过增菌、分离、初筛和鉴定等传统培养法检测。鉴定过程中还使用了鉴定试剂条API Listeria和全自动微生物鉴定系统。同时采用TaqMan实时荧光PCR技术对经过增菌的样品D15与样品D16的培养物和单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株的培养物进行快速鉴定。结果表明,经API Listeria试剂条鉴定,样品D15为单核细胞增生李斯特氏菌,鉴定百分率为98.6%,T值为1;经全自动微生物鉴定系统检测,样品D15为单核细胞增生李斯特氏菌,99%可能性;样品D16为金黄色葡萄球菌,99%可能性;经实时荧光PCR鉴定,样品D15 LB1增菌液培养物及李斯特显色培养基平板上的单菌落都具有显著的S型扩增曲线。综上得出,实时荧光PCR与GB 4789.30—2016的第一法试验结果一致,样品D15为单核细胞增生李斯特氏菌检出,样品D16为单核细胞增生李斯特氏菌未检出,TaqMan实时荧光PCR方法可用于微生物的快速检验,尤其是对盲样检测的辅助验证。

多方法联用对单核细胞增生李斯特氏菌及李斯特菌属的分离鉴定

目的:准确分离鉴定复杂样品基质中的单核细胞增生李斯特氏菌及李斯特菌属。方法:依据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌》(GB 4789.30—2016)进行检测,利用病原微生物快速检测系统(BAX System Q7)对能力验证中的两份样品进行快速筛选,采用全自动微生物鉴定仪(Phoenix M50)分析鉴定可疑菌株。结果:BAX System Q7法与国标法检测结果一致,编号为A的样品检出伊氏李斯特氏菌,编号为B的样品检出单核细胞增生李斯特氏菌。结论:BAX System Q7法简便快速,Phoenix M50系统操作简单、自动化程度高,因此在检测复杂样品基质时,可以先用国标法检测单核细胞增生李斯特氏菌,再采用BAX System Q7系统和Phoenix M50系统进行双向验证,以确保检测结果的准确性。

进出境大中动物中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法的研究

为快速检测进出境大中动物中的单核细胞增生李斯特氏菌,将细菌学方法和实时荧光PCR检测方法相结,利用叠氮溴化丙锭(PMA)抑制死菌核酸扩增的特性,对样品进行前处理,构建一套针对进出境大中动物中具有传染性的单核细胞增生李斯特氏菌PMA-qPCR实时荧光快速检测方法。

单核细胞增生李斯特氏菌内化素InlJ对噬菌体敏感性及生物被膜形成的影响

为深入探索单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,Lm)inlJ基因在噬菌体敏感性和生物被膜中的作用及功能,本研究通过同源重组构建inlJ基因缺失株Lm NJ05-ΔinlJ,鉴定其生长、黏附及侵袭特性,解析其对噬菌体敏感性和生物被膜形成中的作用机制。结果表明:与野生型Lm NJ05相比,构建的缺失株Lm NJ05-ΔinlJ对RAW264.7细胞的黏附率和侵袭率分别为20.05%和4.42%,黏附和侵袭能力显著减弱;Lm NJ05-ΔinlJ对李斯特菌噬菌体vB-LmoM-NJ05的成斑率提高至2.72倍;体外裂解分析表明噬菌体vB-LmoM-NJ05对缺失株Lm NJ05-ΔinlJ裂解效果更强;噬菌体效价分别在105PFU/mL和108PFU/mL能够完全抑制和清除Lm NJ05-ΔinlJ生物被膜;生物被膜形成相关基因的转录分析表明,噬菌体作用缺失株Lm NJ05-ΔinlJ后,degU、agrA、agrD、luxS、yneA、recA和hpt基因的转录均下调(表达水平趋向于0)。由此可见,inlJ基因的缺失能够增强Lm对噬菌体敏感性,下调Lm对细胞侵袭力和生物被膜形成能力。因此,内化素基因inlJ不仅具有调控Lm自身的作用,还能够调节其对噬菌体的相互作用,为噬菌体的生物防控技术开发和应用奠定基础。