小鼠单核巨噬白血病细胞培养条件优化

目的探讨小鼠单核巨噬白血病细胞的细胞培养方法。方法采用胰酶消化和细胞刮棒的方法获得细胞最适的传代方法,比较培养基酸碱度、培养耗材等确定最佳培养条件。结果采用细胞刮棒方法,沿着细胞培养瓶一端顺势往另一端轻柔刮取细胞比胰酶消化法获得的细胞传代,对细胞的损伤更小,细胞状态更好,在所有细胞培养条件中,培养耗材的高压灭菌和培养基的酸碱度对细胞的影响最大,在培养过程中需要采取180℃高压灭菌和调节酸碱度来获得细胞的最佳状态。结论采用DMEM高唐培养基+10%FBS,细胞刮棒沿着一个方向轻轻刮取细胞,传代的比例最佳为1:4,采用过滤的HEPES每次实验时调节培养基酸碱度,是细胞的最佳培养条件。

依达拉奉对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用

目的 探讨依达拉奉(EDA)对小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7炎性反应的抑制作用。方法 以脂多糖诱导RAW264.7细胞,复制炎性细胞模型。采用CCK-8法检测EDA的细胞毒性作用。实验分为空白组(等体积培养基)、模型组(等体积培养基)、给药组(40μg/mL EDA)。采用Griess法检测细胞中一氧化氮(NO)水平,采用酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞中前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素18(IL-18)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、活性氧(ROS)水平;采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)法测定细胞中IL-1β和IL-18 mRNA表达水平;采用Western blot法检测细胞中JAK2/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路相关蛋白JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,IL-1β,IL-18的蛋白表达水平。结果 与0μg/mL比较,20,40,80,160μg/mL EDA处理下细胞存活率无显著变化(P <0.05)。与模型组比较,给药组细胞中NO,PGE2,IL-1β,IL-18,TNF-α,ROS水平均显著降低(P <0.05);IL-1β与IL-18 mRNA及蛋白表达水平和p-JAK2/JAK2与p-STAT3/STAT3均显著降低(P <0.05)。结论 EDA可能通过抑制JAK2/STAT3通路的激活而抑制RAW264.7细胞的炎性反应。

灵芝多糖对单核巨噬白血病细胞株的体外作用

目的：研究灵芝多糖对单核巨噬白血病细胞THP-1和RAW264.7的肿瘤生物学活性的影响。方法：用1、50和100μg/ml的灵芝多糖和脂多糖（LPS）刺激THP-1和RAW264.7细胞,CCK-8法测定巨噬细胞的增殖活力、流式细胞仪检测细胞的凋亡活性、Q-PCR检测细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12基因、相关凋亡信号通路基因TRADD、TNFSF10、TNFRSR10b、NFκBI、Caspase10和Caspase 3基因的mRNA表达水平。结果：灵芝多糖可以呈反浓度依赖性地刺激两种细胞的增殖,在50和100μg/ml浓度下可引起细胞凋亡,凋亡信号基因TNFRSR10b和NFκBI的mRNA水平在24h升高了53%和48%;在1~100μg/ml浓度下可上调细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12细胞因子mRNA的表达水平。结论：灵芝多糖对白血病细胞株具有双重作用,在低浓度下促进细胞增殖,而在高剂量时诱导细胞凋亡,均可上调免疫相关细胞因子的表达。

青藤碱对α7nAChR参与的巨噬细胞M2极化和小鼠肝癌TAM极化的干预作用

目的 观察青藤碱对巨噬细胞M2极化及小鼠肝癌腹水瘤模型腹腔肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophage,TAM)的影响。方法 细胞实验以白细胞介素(IL)-4(10 ng·mL^(-1))单独或与IL-6联合(即IL-4+IL-6,浓度均为10 ng·mL^(-1))刺激小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7诱导M2极化,青藤碱(400μmol·L^(-1))干预后,ELISA法检测IL-10分泌量;荧光定量PCR法检测精氨酸酶1(Arg-1)、Fizz1和Ym1的mRNA表达水平;免疫印迹法检测α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达。动物实验分为正常组、模型组、青藤碱(40 mg·kg^(-1))组,采用小鼠肝癌细胞H22腹腔注射诱导小鼠腹水瘤模型,灌胃给药4 d,分离各组小鼠腹腔巨噬细胞,流式检测CD86、CD206和α7nAChR表达。结果 IL-4或IL-4+IL-6联合诱导后,M2极化指标Arg-1、Fizz1和Ym1的mRNA相对表达量及IL-10分泌量升高(P<0.05);IL-4+IL-6组明显高于IL-4单独组(P<0.05),且α7nAChR表达升高(P<0.05);青藤碱可下调M2表型,也可下调α7nAChR表达(均P<0.05)。肝癌腹水瘤小鼠腹腔肿瘤相关巨噬细胞与正常小鼠腹腔巨噬细胞比较,其CD86表达下降(P<0.05),CD206、α7nAChR表达上调(P<0.05);青藤碱干预后,CD86表达上调(P<0.05),CD206、α7nAChR表达下降(P<0.05)。结论 α7nAChR表达与M2极化和肿瘤相关巨噬细胞极化正相关,青藤碱能下调α7nAChR表达,抑制M2极化、促进肝癌腹水瘤中肿瘤相关巨噬细胞向M1极化。

miR-497对THP-1巨噬细胞NLRP1表达及胆固醇流出的影响

目的探讨miR-497对人单核细胞白血病(THP)-1巨噬细胞含有Pyrin结构域NLR家族蛋白(NLRP)1表达及胆固醇流出的影响。方法THP-1巨噬细胞,经佛波酯及氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)处理,转化为泡沫细胞。将miR-497 mimic转染入细胞内,采用油红O和Dil Ox-LDL染色检测细胞中的脂质积累和胆固醇流出情况,实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测NLRP1 mRNA表达水平,Western印迹检测NLRP1、CD36、白细胞介素(IL)-1β及IL-18蛋白水平及荧光素酶报告基因分析miR-497与NLRP1的直接作用。结果油红O染色表明,miR-497 mimic转染后24 h,细胞中脂质储存显著下降(P<0.05)。利用Dil Ox-LDL来追踪Ox-LDL摄取,发现miR-497 mimic转染后24 h和48 h的胆固醇流出量显著高于对照组(P<0.05)。与对照组相比,miR-497 mimic转染显著降低了THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的NLRP1蛋白表达(P<0.05),并且CD36和IL-1β、IL-18等促炎因子蛋白表达显著降低(P<0.05)。NLRP1用荧光素酶报告基因检测miR-497的靶基因,并且与对照组相比,miR-497 mimic可显著抑制NLRP1 mRNA表达(P<0.05)。结论miR-497通过靶向抑制THP-1巨噬细胞NLRP1,促进胆固醇流出。

ox-LDL诱导的Raw264.7细胞炎症因子表达变化及PPARγSer273磷酸化调控作用观察

目的观察氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞株Raw264.7炎症因子的表达变化及PPARγSer273磷酸化的调控作用,探讨PPARγSer273磷酸化在动脉粥样硬化(AS)中的作用。方法取Raw264.7细胞并分为ox-LDL组和对照组,ox-LDL组以50 mg/L ox-LDL诱导,对照组不予处理,采用ELISA法检测两组细胞培养液中的TNF-α、IL-1β,Western blot法检测细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和PPARγSer273磷酸化蛋白,计算PPARγSer273磷酸化与PPARγ蛋白相对表达量的比值。取缺陷型Raw264.7细胞并分为4组,S273A+ox-LDL组细胞经PPARγSer273突变型质粒转染,并以50 mg/L ox-LDL诱导;S273A组细胞经PPARγSer273突变型质粒转染,但不予50 mg/L ox-LDL诱导;WT+ox-LDL组经PPARγ野生型质粒转染,并以50 mg/L ox-LDL诱导;WT组经PPARγ野生型质粒转染,但不予50 mg/L ox-LDL诱导;采用ELISA法检测细胞培养液中TNF-α和IL-1β分泌量,实时荧光定量PCR法检测细胞中TNF-α和IL-1βmRNA。结果ox-LDL组和对照组TNF-α的分泌量分别为229.43±10.92、186.85±16.12,IL-1β分泌量分别为69.68±6.87、54.80±3.27,PPARγSer273磷酸化与PPARγ蛋白相对表达量的比值为0.67±0.06、0.55±0.01,两组比较,P均<0.05。S273A+ox-LDL组、S273A组、WT+ox-LDL组、WT组TNF-α分泌量分别为333.05±41.44、251.47±24.73、445.68±31.63、373.64±37.59,TNF-αmRNA相对表达量分别为1.35±0.28、0.63±0.12、2.37±0.21、1.00±0.00,IL-1β分泌量分别为83.25±4.74、67.56±6.14、110.73±10.01、94.47±7.48,IL-1βmRNA相对表达量分别为1.18±0.09、0.67±0.13、1.55±0.15、1.00±0.00,S273A+ox-LDL组与WT+ox-LDL组比较,S273A组与WT组比较,P均<0.05。结论PPARγSer273磷酸化通过促进ox-LDL诱导的Raw264.7细胞炎症因子TNF-α和IL-1β的分泌和表达,促进了AS进程。

CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

目的利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白(MGP)基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA(gRNA),人工合成gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的LentiCRISPRv2质粒中,构建成LentiCRISPRv2 MGP gRNA重组质粒。将重组质粒与psPAX2、VSVG包装质粒一同转染293 T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证MGP mRNA及蛋白表达水平。qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了LentiCRISPRv2 MGP gRNA重组质粒,成功包装了含有MGP gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达MGP的RAW264.7细胞系。qPCR及蛋白质印迹法检测显示,其MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P<0.05)。qPCR结果显示,最具有代表性的LentiCRISPRv2 MGP gRNA1细胞破骨标志分子Itgb3(2.29±0.17)、Acp5(2.86±0.15)、Ctsk(2.07±0.13)的mRNA水平均显著上调(P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了MGP基因敲除的RAW264.7细胞系,敲除MGP后RAW264.7细胞破骨分化能力增强。

四种小鼠破骨细胞体外诱导培养方法的比较

[目的]比较不同的破骨细胞体外诱导培养方法，为研究外源性因素对骨代谢影响提供方法学基础。[方法]采用骨髓基质细胞和骨髓单核细胞三维共育、骨髓基质细胞培养液转移刺激骨髓单核细胞、重组核因子-κB受体激活物配基（RANKL）诱导骨髓单核细胞和RANKL诱导单核巨噬细胞株RAW264．7四种方法体外诱导破骨细胞。活细胞示踪剂CM-DiI标记RAW264．7后，用激光共聚焦显微镜扫描观察破骨细胞形成过程；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色法染色破骨细胞。[结果]四种方法均成功地诱导培养出由多个细胞互相融合的TRAP阳性多核破骨细胞。加入RANKL的方法诱导出的破骨细胞较大，数量也较多，方法简单。正常骨髓基质细胞诱导形成的破骨细胞形态较小，数量也相对较少，过程复杂，但可以用来研究干预因素作用于骨髓基质细胞后对破骨细胞分化的间接影响。在对照组及诱导培养体系中均可观察到一类不互相融合的TRAP阳性细胞，含1～3个核，TRAP染色多集中在胞核周围，此类细胞可能是尚未分化的破骨细胞前体。而互相融合的破骨细胞TRAP染色见于整个胞浆。[结论]各种破骨细胞体外诱导培养方法各有优势，应根据不同的实验目的选用不同的破骨细胞诱导培养方法。