IL-4，GM-CSF体外诱导猪单核来源树突状细胞和功能鉴定

目的探讨体外大量培养扩增猪外周血单核细胞来源DC（monocyte—derived DC，MoDC），对细胞表型，免疫学功能及生物学活性进行鉴定。方法提取猪外周血单核细胞（PBMC），经GM—CSF和IL-4诱导，体外培养5-8d，得到悬浮的MoDC，培养第5天加入浓度为1μg/ml的LPS诱导成熟。通过倒置相差显微镜下观察MoDC细胞形态，流式细胞术检测表面CD80／86，SLA-II，CD172a等分子表达，BrdU法测定混合淋巴细胞培养MoDC对同种异体T细胞的刺激能力，ELISA法检测MLR上清液中IFN—γL-4水平。结果IL-4／GM—CSF刺激猪PBMC，可以获得MoDC，其表型为CD1^＋CD14^＋CD172a^＋CD80／86^＋SLA—II^＋，经LPS刺激后CD80，CD86，SLA—II表达升高。结论应用细胞因子诱导猪PBMC成功获得了MoDC，为今后进一步研究移植耐受诱导和应用于异种移植打下基础。

EB病毒对新生儿脐带血单核细胞来源的树突状细胞表型的影响

从脐带血单核细胞来源树突状细胞(DC)表型变化的角度来探讨EB病毒对DC表型的影响,以阐明其逃逸宿主免疫的机制。将GM-CSF和IL-4、EB病毒和LPS不同组合对单核细胞来源DC进行刺激培养,利用单染色和三染色免疫荧光抗体标记—流式细胞术检测单核细胞来源DC表面CD14、CD11c、CD1a、HLA-DR、CD86、MR和MHCⅠ类分子。加入EB病毒后,DC表面CD14分子表达的下调不明显,CD1a的表达则随病毒加入时细胞的分化阶段有关;同时EB病毒还影响了加入LPS后HLA-DR和CD86的升高和MR的降低;EB病毒还影响了细胞表面MHCⅠ类分子的表达。因此EB病毒可抑制单核细胞来源DC的分化和成熟,这可能是其逃逸宿主免疫的机制之一。

紫杉醇对人单核细胞来源树突状细胞免疫功能的影响

目的研究紫杉醇对人树突状细胞(DC)免疫功能的影响。方法分离外周血单个核细胞,在含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)、胎牛血清及有或无紫杉醇的培养条件下制备DC。用流式细胞仪检测DC表型(CD1a、CD86、HLA-DR),混合淋巴细胞反应(MLR)检测DC对同种异体T淋巴细胞的刺激能力,流式细胞仪检测DC吞噬功能和凋亡细胞数,ELISA法测定MLR上清液细胞因子。结果与对照组比较,经紫杉醇处理的DC表面CD1a、CD86、HLA-DR表达明显降低(均P<0.01),对T淋巴细胞刺激能力下降(均P<0.01),细胞吞噬能力下降(均P<0.05),凋亡细胞数增加(均P<0.01);MLR中细胞因子(IL-10、IL-12、TNF-α)浓度降低(均P<0.01)。结论紫杉醇对DC免疫功能有明显抑制作用,可能是其防止支架术后再狭窄的机制之一。

少量人外周血体外培养鉴定单核细胞来源树突状细胞方法初探

目的:在少量人外周血条件下体外培养并鉴定单核细胞来源树突状细胞(Monocyte-derived dendritic cells,Mo DC)。方法:取健康成人少量新鲜外周血经改良密度梯度离心法分离获得单核细胞,加入重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rh GM-CSF)、重组人白细胞介素4(rh IL-4)诱导Mo DC生长,并用肿瘤坏死因子α(TNF-α)刺激成熟,倒置显微镜及扫描电镜观察细胞形态;分别于培养第4天和第7天用流式进行表型鉴定、CCK-8法检测同种异体混合淋巴细胞反应鉴定抗原递呈能力。结果:Mo DC呈类圆形,聚集成团,悬浮生长,扫描电镜观察其表面有典型毛刺状突起;流式检测Mo DC高表达CD11c、CD1a,经TNF-α刺激后的Mo DC表面MHCⅡ、CD80、CD83、CD86表达均较培养4 d的Mo DC明显升高,具有统计学意义(P<0.05);经TNF-α刺激后的Mo DC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力较培养4 d的Mo DC明显升高,具有统计学意义(P<0.05)。结论:用本实验方法可从少量人外周血中获得成熟Mo DC,为其在多种变态反应疾病、自身免疫性疾病及肿瘤疫苗等领域的研究提供基础保障。

STAT3信号通路在IL-6抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达中的作用

目的探讨STAT3信号通路在IL-6抑制人单核细胞来源树突状细胞(human monocytederived dendritic cells,mo DCs)趋化因子受体7(C-C chemokine receptor type 7,CCR7)表达中的作用。方法采用CD14+磁珠分离法从外周血中分离得到单核细胞,加入rh GM-CSF和rh IL-4在体外诱导培养树突状细胞。LPS用于刺激mo DCs表达CCR7,RT-PCR检测不同浓度IL-6处理后再用LPS刺激后的mo DCs CCR7 mRNA表达。Western blot检测IL-6处理mo DCs和IL-6预处理后再加入STAT3磷酸化特各异性抑制剂JSI-124的mo DCs STAT3、p-STAT3表达。IL-6预处理并抑制STAT3磷酸化后,LPS刺激48 h,RT-PCR检测mo DCs CCR7 mRNA的表达,流式细胞仪检测mo DCs CCR7蛋白表达,细胞迁移实验检测mo DCs细胞迁移功能。结果与单独LPS刺激组比较,IL-6明显抑制LPS刺激的mo DCs CCR7mRNA的表达(P<0.05)。Western blot结果显示,与单独LPS刺激组比较,IL-6导致mo DCs细胞内STAT3高度活化;而抑制STAT3信号高度活化后,与IL-6+LPS处理组比较,mo DCs CCR7 mRNA表达、蛋白分子表达、细胞迁移能力明显升高(P<0.05),与LPS刺激组无差异(P>0.05)。结论 IL-6通过高度活化STAT3信号通路抑制人单核细胞来源树突状细胞CCR7表达,导致树突状细胞的迁移能力受损,而靶向干预STAT3通路可能成为纠正树突状细胞迁移障碍的潜在手段。

特异性免疫治疗对单核细胞及其来源的树突状细胞表型的早期影响

目的探讨抗原特异性免疫治疗对单核细胞及其来源的树突状细胞表达与免疫相关的重要表型的早期影响。方法 20名接受黄蜂毒液免疫治疗的患者,在治疗前(day0)和治疗后第1天(day1)、第3天(day3)和第5天(day5)抽取外周静脉血分离单核细胞(Mo),其中10名患者的单核细胞在体外培养6d诱导分化为单核细胞来源的树突状细胞(MoDC),流式细胞仪检测其表面ILT3,ILT4,B7H1,B7H2,MHCⅠ,MHCⅡ,CD80和CD86的表达。结果单核细胞和MoDC表面ILT3和ILT4表达显著增高,B7H1和CD86表达显著降低,与治疗前比较,差异有统计学意义(P<0.01)。未观察到B7H2,MHCⅠ,MHCⅡ和CD80的显著性改变(P>0.05)。结论单核细胞和MoDC表面的ILT3,ILT4,B7H1和CD86分子参与抗原特异性免疫治疗的早期耐受。

miR-155在3-oxo-C12-HSL阻碍人单核细胞源性树突状细胞成熟过程中的表达变化

目的探讨miR-155在N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-oxo-C12-HSL)阻碍人单核细胞源性树突状细胞(Mo-DCs)成熟过程中的表达变化。方法分离正常人外周血CD14+单核细胞,经重组人粒-单核细胞集落刺激因子和重组人IL-4诱导分化为Mo-DCs。将不成熟Mo-DCs分为阴性对照组、模型组、实验组1、实验组2,阴性对照组加入同体积PBS,模型组加入终浓度为1μg/m L的LPS,实验组1和实验组2分别加入终浓度为1μg/m L的LPS后分别加入终浓度为50μmol/L和100μmol/L的3-oxo-C12-HSL,处理48 h。采用流式细胞术检测各组Mo-DCs表型(CD80、CD40、CD11c和HLA-DR),酶联免疫吸附法检测细胞培养上清细胞因子(IL-12、IL-10)水平,荧光定量PCR检测miR-155表达。结果与阴性对照组相比,模型组CD80、CD40、HLA-DR表达高,IL-10水平低,IL-12水平高,miR-155表达高(P均<0.05)。实验组1、实验组2与模型组相比,实验组2与实验组1相比,CD80、CD40、HLA-DR表达低,IL-10水平高,IL-12水平低,miR-155表达低(P均<0.05)。结论 miR-155在3-oxo-C12-HSL阻碍人Mo-DCs成熟过程中表达降低,3-oxo-C12-HSL可能通过降低miR-155表达阻碍Mo-DCs成熟。

3-O-C12-HSL通过PPARγ拮抗树突状细胞表达RP11-367F23.2

目的 研究N-3-氧代十二烷酰-L-同型丝氨酸内酯(3-O-C 12 -HSL)是否抑制单核细胞来源树突状细胞(Mo-DCs)表达RP11-367F23.2,该抑制作用是否通过过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)介导。方法 采用密度梯度离心法分离单核细胞来源的Mo-DCs;将Mo-DCs细胞分为4组:脂多糖(LPS)组、3-O-C 12 -HSL组、GW9662组和PBS组,18 h后收集细胞;荧光定量PCR检测4组中RP11-367F23.2表达情况。结果 Mo- DCs经3-O-C 12 -HSL刺激后,RP11-367F23.2表达量降低,3-O-C 12 -HSL组和LPS组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05);Mo-DCs经GW9662处理后,细胞中的RP11-367F23.2表达量升高,3-O-C 12 -HSL组和GW9662组RP11-367F23.2表达量比较,差异有统计学意义( P <0.05)。结论 3-O-C 12 -HSL通过PPARγ拮抗Mo-DCs表达RP11-367F23.2。

胃癌患者Hp感染对外周血MODCs成熟及活化的影响

目的研究胃癌患者幽门螺杆菌(Hp)感染对外周血单核细胞来源树突状细胞(MODCs)成熟及活化的影响。方法将106例胃癌根据是否感染Hp分为阳性组67例(CagA^+菌株39例,CagA^-菌株28例),阴性组39例,采集两组外周血并分离单个核细胞,诱导单个核细胞产生树突状细胞(DCs),比较两组DCs成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86及HLA-DR表达情况,检测DCs致敏T细胞对癌细胞的毒性杀伤作用,并检测白细胞介素-12(IL-12)、人干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子的釋放水平。结果阳性组CagA^+菌株、CagA^-菌株的CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达率均高于阴性组(均P<0.05);阳性组IL-12、IFN-γ水平均高于阴性组(P<0.05);阳性组癌细胞毒性杀伤率高于阴性组(P<0.05)。结论胃癌患者Hp感染可刺激MODCs成熟及活化,提高癌细胞杀伤作用。

人膜型LIGHT分子对Mo-DC成熟和T细胞激活的调节作用

利用我们建立的表达人膜型LIGHT分子的基因转染细胞(L929/LIGHT)探讨LIGHT/HVEM信号体外对Mo-DC诱导分化的影响,并进一步研究其对T细胞活化和抗凋亡的共刺激作用。从健康人外周血中分离的单核细胞经GM-CSF联合IL-4诱导形成Mo-DC,流式细胞术分析Mo-DC诱导过程中HVEM和LIGHT的表达;基因转染细胞L929/mock、L929/LIGHT、L929/CD40L或L929/LIGHT联合L929/CD40L,分别经丝裂霉素处理后,与GM-CSF联合IL-4诱导的Mo-DC共育,流式细胞术检测Mo-DC细胞表面成熟标志CD83和CD86的表达,利用FITC-Dextran分析Mo-DC对抗原的摄取能力;L929/LIGHT或L929/mock经丝裂霉素处理后,与抗人CD3单抗激发的T细胞共育,流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞表面活化标志CD25的表达,Annexin V和PI双标记分析T细胞的凋亡率。结果表明,高表达HVEM的单核细胞在诱导形成成熟Mo-D(iDC)的过程中下调了HVEM的表达,成熟Mo-DC(mDC)又上调表达HVEM,而LIGHT在Mo-DC分化过程中呈短暂的诱导性表达;基因转染细胞L929/LIGHT及其联合L929/CD40L能上调Mo-DC表面共刺激分子CD83和CD86的表达,并下调Mo-DC对FITC-Dextran的摄取能力;L929/LIGHT细胞能上调CD4+、CD8+T细胞CD25的表达,并增强T细胞抗凋亡能力。因此,基因转染细胞L929/LIGHT表面表达的人膜型LIGHT分子介导的LIGHT/HVEM共刺激信号对Mo-DC的诱导成熟和T细胞活化及抗凋亡能力具有促进作用。