单核细胞单层试验在预测IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病中的应用

目的探讨单核细胞单层实验(monocyte monolayer assay,MMA)是否能够用于IgG抗-M相关胎儿新生儿溶血病(hemolytic disease of fetus and newborn,HDFN)的预测。方法选取8例含有IgG抗-M的孕妇并采集血浆标本,其中有胎儿水肿等严重临床症状及无明显临床症状的各4例;8份血浆用二硫苏糖醇(dithiothreitol,DTT)灭活,与M抗原阳性红细胞孵育致敏后,将致敏红细胞与单核细胞混合进行吞噬试验,同时设立阳性及阴性对照,并计算吞噬率;采用t检验对2组吞噬率进行比较。结果4例发生严重抗-M相关HDFN的孕妇的MMA吞噬率分别为15.37%、13.05%、9.17%和24.50%,均值为15.52%;检出IgG抗-M但未发生HDFN的孕妇,其MMA吞噬率分别为8.74%、11.07%、5.12%和6.23%,均值为7.79%,2组吞噬率无差异(P>0.05)。2组吞噬率分别与阴性对照比较均无差异(P>0.05),但均明显低于阳性对照(P<0.05)。结论IgG抗-M介导单核细胞吞噬的能力较低,提示抗-M导致胎儿水肿的机制可能并非红细胞被吞噬破坏而发生的溶血,因此体外单核细胞单层实验可能不适用于IgG抗-M相关HDFN的预测。对于检出IgG抗-M的孕妇,现仍需通过定期监测胎儿大脑中动脉血流,来判断胎儿宫内贫血情况。

单核细胞单层试验和抗体效价测定预判新生儿溶血病的比较

目的应用单核细胞单层试验和抗体效价测定试验预判新生儿溶血病的效果比较。方法抽取孕妇外周血进行单核细胞单层试验和IgG抗体效价测定,收集新生儿脐血做新生儿溶血病检查,对两种产前检查试验预判新生儿溶血病的各项评价指标进行比较。结果抗体效价测定预判新生儿溶血病的灵敏度为40.0%,特异性为100.0%,准确率为58.6%;单核细胞单层试验预判新生儿溶血病的灵敏度为75.0%,特异性为77.8%,准确率为75.9%。结论单核细胞单层试验预判新生儿溶血病的效果优于效价测定,将两者结合则是较为理想的产前筛查方案。

单核细胞单层试验预判ABO新生儿溶血病的应用

目的应用单核细胞单层试验(MMA)在产前预测新生儿ABO溶血病(ABO-HDN)发生的可能性,寻找并确定预判ABO-HDN的MMA最终结果参考值。方法对30名孕妇血清做MMA试验,应用血清学技术对新生儿脐血进行ABO-HDN检查,确定新生儿发病与否。结果单核细胞单层试验预测新生儿溶血病其灵敏度为92.9%,特异性为81.3%,准确率为86.7%,确定MMA最终结果5%为参考值。结论通过试验证明MMA在预判ABO-HDN中具有临床意义。提示MMA最终结果≥5%有92.9%的可能发生ABO-HDN,<5%表示发生ABO-HDN的可能性较小。

单核细胞单层试验在ABO系统新生儿溶血病中的应用

目的比较单核细胞单层检测方法(MMA)与血型血清学方法在诊断ABO系统新生儿溶血病(HDN)中的作用。方法对74名孕妇在孕22周、32周、36周以及新生儿出生当天的血液分别进行抗体效价检测和MMA实验,并对这两种方法进行评价。结果抗体效价检测的灵敏度为80.9%,特异性为73.9%,阴性预示值为65.4%,阳性预示值为79.2%,准确率为74.3%,而MMA的相应评价指标分别为89.4%,85.2%,82.1%,91.3%,和87.8%。结论在早期诊断ABOHDN时,MMA方法较抗体效价测定更为灵敏和准确。

免疫过氧化物酶单层细胞试验检测猪圆环病毒Ⅱ型抗体方法的建立

猪圆环病毒病（PCVD）是由猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）引起的猪传染性疫病，是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的又一重要疫病，临床主要表现为生长迟缓、进行性消瘦、呼吸困难、黄疸、腹泻、皮炎、繁殖障碍、震颤等。自1997年Clark等人首次分离到PCV-2以来，该病已给全世界养猪业造成巨大的经济损失，我国为养猪大国，PCV-2感染也相当严重，全国各大小猪场均存在PCV一2感染的报道。

流式细胞术检测单核细胞体外吞噬致敏红细胞实验方法的建立

目的建立流式细胞术检测单核细胞体外吞噬致敏红细胞的实验方法。方法从献血者外周血中分离单个核细胞,在培养板中体外培养1 h,分离并获取贴壁的单核细胞。采用PKH26荧光染料标记Dib阳性红细胞、IgG抗-Dib单抗致敏已标记红细胞,将致敏红细胞加入到单核细胞中进行体外吞噬试验(阳性对照组)。同时以10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640致敏红细胞组作为阴性对照。用FITC抗人CD14标记单核细胞,通过流式细胞术检测吞噬情况,并计算吞噬效率。并采用该方法检测单核细胞对不同效价人源IgG抗-D致敏红细胞的吞噬效率。结果阴性对照组与阳性对照组中,单核细胞吞噬率分别平均为5%(1.2%~7.6%,SD值为3.30)与81%(71.4%~92.7%,SD值为8.65)。抗-D介导的单核细胞吞噬活性与效价相关,抗体效价<32时,吞噬效率在10%以内;抗体效价在32~128时,吞噬效率呈指数增长;抗体效价≥256时,吞噬效率进入平台期,稳定在80%。结论成功建立了流式细胞术检测单核系统体外吞噬致敏红细胞的检测平台,可用来评估红细胞同种或自身IgG抗体是否具有临床意义。

ssDNA适配体阻断FcγR介导巨噬细胞吞噬作用的研究

目的验证ssDNA适配体阻断RhD抗原-抗体的结合,进而阻断FcγR介导巨噬细胞吞噬作用的能力。方法0.2%红细胞悬液分为三组:实验组(加入经ssDNA处理过的RhD IgG单克隆抗体)、空白对照(未处理的红细胞悬液)、阳性对照(加入未经ssDNA处理的RhD IgG单克隆抗体)。37℃孵育30 min。洗涤后加入1∶500的羊抗人IgG Alexa Fluor 488荧光抗体,37℃,30 min。洗涤后流式细胞仪检测。单核细胞单层试验收集6人份外周血单核细胞于37℃混合培养1h,洗去未贴壁细胞。以2∶1体积加入不含荧光抗体的三组红细胞,培养1.5 h后进行瑞氏-姬姆萨染色。镜下观察500个单核细胞,计算平均吞噬指数。结果流式结果显示,阳性对照荧光强度为3 166.33±172.55,而实验组荧光强度仅为307.00±45.18,与空白对照组(287.33±30.50)无显著性差异。MMA实验结果显示,阳性对照组单核细胞平均吞噬指数(7.20±1.48)Cut-off值(0.35),结果为阳性;试验组的吞噬指数(0.07±0.12)低于Cut-off值,结果为阴性。结论 ssDNA与RhD抗体结合后可使RhD抗体丧失与RhD抗原特异性结合的能力,以至于红细胞不会被致敏,为新生儿溶血病的治疗提供了新的思路。

流场对细胞黏附及其后内皮细胞VE-cadherin表达的影响

目的:探讨不同流场对THP-1单核细胞与ECV304内皮细胞黏附的影响及细胞黏附后内皮细胞VE-cadherin表达及分布。方法:不同流场作用单层内皮细胞及单核细胞6h,观察不同流场下单核细胞与内皮细胞黏附;用W estern蛋白印迹法检测黏附后VE-cadherin的表达,用免疫细胞化学方法在激光共聚焦显微镜下观察VE-cadherin蛋白在内皮细胞中的分布变化。结果:不同流场作用单层内皮细胞及单核细胞6 h,发现低剪切力层流组与高剪切力层流组黏附的单核细胞均数分别为59.8/视野及3/视野,低剪切力紊流组与低剪切力层流组黏附的单核细胞均数分别为125/视野及61/视野,低剪切力紊流下单核细胞黏附数高于低剪切力层流及高剪切力层流,且在低剪切力紊流组中有大量单核细胞成簇黏附于内皮细胞上;单核细胞与内皮细胞共育0、1、2、4 h后,VE-cadherin蛋白的表达量在各组细胞间无差异;0 h组VE-cadherin着色集中于内皮细胞周边即细胞与细胞之间,1h,2h,4h时VE-cadherin着色不再集中于细胞周边而是分散到整个内皮细胞膜。结论:低剪切力紊流环境下,单核细胞与内皮细胞的黏附增加且形成了较多的成簇黏附,细胞黏附后内皮细胞膜上VE-cadherin的分布随之改变。

基于SodC单克隆抗体的胞内劳森菌IPMA抗原检测方法的建立及应用

【目的】胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)是引起猪增生性肠炎(porcine proliferative enteritis,PPE)的肠道病原菌,主要表现为动物福利下降,给世界养猪业造成严重的经济损失。研究通过制备鼠抗LI SodC的单克隆抗体,建立一种针对LI的免疫过氧化物酶细胞单层试验(IPMA)抗原检测方法,检验其在临床上的应用性,从而为LI的病原诊断提供一种科学有效的手段。【方法】选取胞内劳森菌弱毒疫苗为研究对象,通过PCR扩增其sodc片段,将其克隆至原核表达载体pGex-6p-1上,成功构建出pGex-6p-1-sodc重组质粒,诱导表达重组蛋白SodC。Western Blot分析重组蛋白的反应原性,一抗使用鼠抗GST标签的抗体。以该重组蛋白为免疫原,免疫4—6周龄BALB/c小鼠,利用常规细胞融合技术、有限稀释法和间接ELISA技术筛选阳性杂交瘤细胞,并制备腹水。通过间接免疫荧光(IFA)鉴定该单抗的特异性。以该单抗为一抗,摸索并建立了LI IPMA抗原检测方法,并评价该方法的特异性、敏感性和重复性。用优化后的IPMA方法对来自江苏周边地区猪场回肠组织样品进行检测,评价该方法的临床价值。【结果】纯化后SodC蛋白浓度较高,与鼠抗GST标签的抗体发生特异性结合,表明该蛋白反应原性较好。经3次亚克隆后最终共筛选获得2株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1D6和1F7。单抗亚型鉴定结果显示:1D6亚型为IgA,1F7亚型为IgG3;ELISA检测1D6单抗效价为1﹕1024000;1F7单抗效价为1﹕1024000;间接免疫荧光(IFA)结果表明2株单抗均与LI菌株发生特异性反应,与猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Cholerasuis,S.Cholerasuis)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等猪常见病原无交叉反应。优化后IPMA反应条件为:一抗稀释倍数为1﹕800,作用45min;二抗稀释倍数为1﹕2500,作用1h,此时IPMA检测效果最佳。用该方法检测S.Cholerasuis、PEDV、TGEV、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2(PCV2)均为阴性;最低检测限为103个/mL,说明该方法特异性强、敏感性高。临床样品检测结果显示146份病料中共检测出92份阳性样品,3个不同猪场的阳性样品检出率分别为65.6%、68.2%和53.7%,总体阳性率为63.0%。普通PCR方法检测出82份阳性样品,两种方法的阳性符合率为94.6%。【结论】成功制备了鼠抗LI SodC蛋白的单克隆抗体,建立了针对LI抗原的IPMA检测方法,并对临床样品进行了检测。该方法具有良好的特异性和敏感性,并具有一定的临床价值,为实验室LI的分离鉴定、在感染细胞中的定位以及流行病学调查和相关检疫提供一种有效的技术手段。

巴氏涂片试验可有效筛查宫颈癌

据近期出版的《英国医学杂志》(BMJ)刊登的一项横断面研究的结果表明,对宫颈癌筛查而言,单层细胞学方法与常规的巴氏涂片法(Pap试验)相比,前者的可信度较低,且极有可能提供较多的假阳性结果。来自于法国巴黎第五大学的Joel Coste教授及其同事强调指出,目前在一些国家(包括美国、瑞士)中,基于液态的单层细胞学检验有可能与人乳头状瘤病毒试验联合以替代现行的常规涂片法用于宫颈癌的筛查。

抗-Jr^a的临床意义:2例报导及文献综述

背景 Jr^a是所有人群的高频率抗原,然而Jr^a抗体的临床意义尚不充分明了。本文介绍2例具有Jr^a抗体患者接受不匹配输血的情况。病例报告:一例69岁有抗-K及抗Jr^a的日本男性患者。尽管多次输入Jr(a+)、K-红细胞,他的临床经过稳定,没有出现溶血证据。另一例45岁有抗-Jr^a的日本女性患者,接受2单位Jr(a+)红细胞没有出现临床溶血证据。后一患者在初次输血1周后再次输入另外的Jr(a+)红细胞。

2种预判新生儿溶血病方法的比对分析

目的比较IgG抗体效价测定与单核细胞单层试验对预判新生儿溶血病的效果,找到适合新生儿溶血病预判的方法组合。方法分别在孕妇妊娠的不同时间采集血标本,做产前血清学试验和单核细胞单层试验,并按妊娠次数不同进行分类。新生儿出生时收集脐血,进行新生儿溶血病检查。结果 ABO血型不合夫妇,IgG抗体效价和单核细胞单层试验的灵敏度、特异性、准确率依次为76.2%、61.5%、70.9%和90.1%、64.6%、81.0%。Rh(D)不合夫妇,IgG抗体效价和单核细胞单层试验的灵敏度、特异性、准确率,均依次为100%、94.1%、95.7%。11名早产新生儿,IgG抗体效价和单核细胞单层试验的灵敏度、特异性、准确率均为100%。结论预判ABO新生儿溶血病单核细胞单层试验总体优于IgG抗体效价测定,可根据患者的实际情况,在进行IgG抗体效价测定的同时,有选择地开展单核细胞单层试验。

一种新的病毒空斑技术

本文报道了一种不同于 Dulbecco 细胞单层法和 Cooper 琼脂细胞悬浮法的病毒空斑技术—速成单层法病毒空斑试验。用24孔细胞培养板,不经预先制备细胞单层,将 Vero 细胞和水泡性口炎病毒 Indiana 株同时加入培养孔内。

选择性siRNA干扰FCGRⅡA影响THP-1吞噬调理红细胞

为探讨能否通过小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)干扰影响巨噬细胞Fcγ受体介导的吞噬作用,采用FCGRⅡA siRNA转染佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)活化人单核细胞THP-1,并设NO-TARGET、GAPDH、no-siRNA(1640)为对照。培养48~72h后,用FCM分析CD14+细胞的CD32、CD32b分布,用CD14的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)值作为内参,得到CD32、CD32b相对MFI值;用Western blotting观察CD32a、CD32b的蛋白表达水平;进行单核细胞单层实验(monocyte monolayer assay,MMA),结合流式细胞术分析THP-1中能吞噬调理红细胞的吞噬百分比。采用配对t检验分析FCGRⅡA组与各对照组间的分布差异。Western blotting结果证实,FCGRⅡA组CD32a量明显减少(分别为NO-TARGET组、GAPDH组、1640组的22%、42%、31%),而CD32b不降低;FCM分析显示,FCGRⅡA组MFI CD32/CD14较NO-TARGET组、1640组、GAPDH组下降(P<0.05),而CD32b无明显减少;同时MMA结果显示,FCGRⅡA组吞噬细胞占比分别比NO-TARGET组、GAPDH组、1640组减少9.6%、9.2%和4.4%。提示siRNA选择性干扰可有效降低Fcγ受体CD32a表达,并降低PMA活化的THP-1吞噬能力,可作为潜在手段干扰输血反应所涉及的巨噬细胞吞噬作用。

Pap试验是筛查宫颈癌的最好方法

一份横断面调查研究表明，对宫颈癌筛查而言，单层细胞学方法与常规Pap涂片法相比，前者的可信试度较低，并且有较多的假性结果。