单核细胞增生性李斯特氏菌tatD基因缺失对小鼠毒力和肠道菌群的影响

【目的】探究单核细胞增生性李斯特氏菌Listeria monocytogenes tatD基因缺失对小鼠Mus musculus毒力和肠道菌群的影响,为tatD在单核细胞增生性李斯特氏菌与宿主互作中的作用及减毒疫苗研究提供参考。【方法】采用Bliss法将亲本菌株(LM10403s)、缺失菌株(LM10403sΔtatD)和互补菌株(LM10403sCΔtatD)口服感染小鼠,确定菌株对小鼠的半数致死量(LD_(50))。LM10403sΔtatD以1.00×10^(5) CFU口服免疫小鼠观察其免疫保护效果。将40只6周龄雌鼠随机平均分为对照即磷酸缓冲盐溶液组(PBS)、LM10403s组、LM10403sΔtatD组和LM10403sCΔtatD组,PBS组小鼠灌胃200μL无菌PBS,实验组分别灌胃200μL含1.00×10^(6) CFU的菌液。灌胃24 h后剖杀各组小鼠,收集肠道内容物,采用Illumina Hiseq测序技术测定各处理小鼠盲肠样品微生物16S rRNA V3-V4区序列,并比较分析其微生物群落结构、多样性和信号通路富集。【结果】LM10403sΔtatD的LD_(50)为8.11×10^(7) CFU,毒力低于LM10403s。同时LM10403sΔtatD口服免疫小鼠后对单核细胞增生性李斯特氏菌亲本菌株的攻毒能提供80%保护率。Chao1和Observed species指数显示:PBS与LM10403sΔtatD处理组差异不显著,但LM10403s组和LM10403sCΔtatD处理组相比于PBS处理组显著下降(P<0.05)。在门水平上,LM10403sΔtatD处理组的厚壁菌门Firmicutes相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组,而在属水平上,乳杆菌属Lactobacillus相对丰度高于LM10403s和LM10403sCΔtatD处理组。功能预测分析显示:LM10403s处理组在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢等信号通路的富集程度高于LM10403sΔtatD处理组。【结论】tatD基因缺失后单核细胞增生性李斯特氏菌的毒力降低,并具有一定的免疫保护效果。tatD基因缺失菌株感染小鼠对肠道菌群失调影响减小,且有益菌增多。

单核细胞增生李斯特菌LIPI-4 Lm4b_02327的基因克隆、生物信息学分析及原核表达

目的 试验旨在获得单核细胞增生李斯特菌新疆冷冻鸡肉分离株LM928中LIPI-4 Lm4b_02327基因的重组蛋白。方法 根据Gen Bank中LM Clip80459菌株(登录号CAS06084.1)Lm4b_02327序列设计特异性引物,利用PCR对Lm4b_02327基因进行扩增,纯化目的片段后克隆至pMD19-T载体,双酶切筛选阳性克隆进行测序。测序后利用软件预测Lm4b_02327序列编码蛋白质的理化性质、二级结构和三级结构,对该基因片段的核苷酸序列及编码的氨基酸序列进行同源性对比。同时构建pET32a-Lm4b_02327重组质粒,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,诱导表达,经SDS-PAGE检测、纯化蛋白后用Western Blot鉴定。结果 LM928菌株的Lm4b_02327基因全长为315 bp,共编码105个氨基酸,该蛋白为偏酸性、无信号肽、亲水性、无跨膜结构、定位于细胞质的不稳定蛋白,该蛋白质预测为PTSLacEⅡA组分。LM928菌株Lm4b_02327基因的核苷酸和氨基酸序列与CFSAN023463、52854、02-6680、02-6679、ICDC-LM188、LM3、N2306、GTA-L356和Clip80459菌株的同源性均为100.0%,与52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的核苷酸同源性分别为99.7%、97.8%和97.8%,与52860、FSL-J1-158和FSL J1-208菌株的氨基酸同源性分别为99.0%、94.3%和94.3%。系统进化树显示,LM928菌株的Lm4b_02327基因与4b血清型菌株聚为同一分支。经诱导后,pET32a-Lm4b_02327重组质粒在大肠杆菌BL21中大量表达,经SDS-PAGE和Western Blot鉴定表明该重组蛋白大小约为30 kDa,与预期大小一致。结论 本研究成功克隆Lm4b_02327基因,并获得该蛋白的大量表达,为深入研究蛋白功能奠定基础。

用3M Petrifilm^(TM)环境李斯特菌测试片和平板法定量检测肉制品中的单核细胞增生性李斯特菌的比较实验

用3M PetrifilmTM环境李斯特菌测试片和平板法定量检测肉制品中的单核细胞增生性李斯特菌,比较2种检验方法的检验结果表明,PetrifilmTM环境李斯特菌测试片法和平板法检测单核细胞增生性李斯特菌的结果基本一致,适合于肉制品中单核细胞增生性李斯特菌的检测。

LIPI-3和LIPI-4共存对致病性单核细胞增生李斯特菌毒力的影响

【目的】探究单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)毒力岛3(LIPI-3)和LIPI-4共存对LM毒力的影响,揭示它们对细菌毒力的潜在调节作用,为进一步研究LM的致病机制提供依据。【方法】以LM928(存在LIPI-4)和LM873(同时存在LIPI-3和LIPI-4)2个LM菌株为研究对象,通过侵染HCMEC/D3细胞监测2种菌株对HCMEC/D3细胞的黏附和侵袭情况;通过鸡胚感染试验评估2株菌对鸡胚半数致死量(LD 50)的影响;采用溶血试验来测定菌株的溶血活性;通过流式细胞仪分析HCMEC/D3细胞凋亡情况,以评估菌株诱导细胞凋亡的能力;利用实时荧光定量PCR技术比较2株菌在BHI培养条件下及感染HCMEC/D3细胞后毒力基因的转录水平差异。【结果】LM928和LM873株的黏附率无显著差异(P>0.05),LM928株的侵袭率极显著高于LM873株(P<0.01)。LM873株的LD 50是LM928株的约1000倍;LM928和LM873株的溶血价分别为24和23。LM928株感染24和48 h后诱导的细胞凋亡率显著或极显著高于LM873株(P<0.05;P<0.01),而LM873株的凋亡率与对照组间无显著差异(P>0.05)。LM928和LM873株在BHI培养基中培养时,与LM928株相比,LM873株毒力基因mpl、inlB、inlC、inlP、actA、plcA、plcB和sigB的转录水平均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01),毒力基因hly、inlA和iap的转录水平均极显著或显著下调(P<0.01;P<0.05)。LM928和LM873株侵染HCMEC/D3细胞后,与LM928株相比,LM873株毒力基因inlP、actA、plcA、plcB和prfA的转录水平均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);毒力基因hly、mpl、inlA、inlB、inlC和iap的转录水平均极显著下调(P<0.01)。【结论】LIPI-3和LIPI-4共存降低了LM的毒力,该结果对进一步研究LIPI-3和LIPI-4在细菌毒力调控中的分子机制和复杂的相互作用具有重要意义。

饮食业单核细胞增生性李斯特菌污染状况分析

[目的]了解饮食业冷藏设备及食品中单核细胞增生性李斯特菌的污染情况,为制订预防措施提供依据。[方法]采集53家饮食经营单位冷藏食物及冰箱冷藏室内表面涂抹拭子共293份样本,按国标法分离鉴定。[结果]冷藏室内表面涂抹拭子200份样本,单增李斯特菌检出阳性率为4.00%。3类冷藏食品共93份样本,阳性率为3.23%[结论]饮食业冰箱及食品存在交叉污染,控制冷藏温度可有效防止单增李斯特菌污染。

多重PCR快速检测食品中的单核细胞增生性李斯特菌

【目的】通过对检测食源性致病菌单核细胞增生性李斯特氏菌(LM)的多重PCR体系的优化,建立一种能够在食品样品中应用的四重PCR。【方法】采用热裂解提取菌液和菌落DNA,以16SrRNA、inlAB、iap、hly基因为靶基因设计引物,从影响多重PCR扩增的引物浓度、退火温度进行优化。【结果】通过其它5种同属异种菌即英诺克李斯特氏菌、西尔李斯特氏菌、威尔西李斯特氏菌、绵羊李斯特氏菌、格氏李斯特氏菌及副溶血性弧菌均未扩增出特异性的片段。纯培养物的最低检测限为102CFU/mL,模拟污染的生猪肉检测限不大于0.4CFU/g。【结论】通过菌落获得DNA的多重PCR方法更好,该方法具有敏感、特异、快速及准确的优点,可用于食品中LM的快速检测。

单核细胞增生性李斯特菌分子生物学检测技术的研究进展

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是主要食源性致病菌之一,可引起李斯特菌病,感染严重者会出现致死现象。传统的单增李斯特菌检测方法耗时长,步骤繁琐。因此,特异性强,高效性以及简便的检测手段已成为研究热点。本文综述了运用分子生物学手段对单核细胞增生性李斯特菌检测的研究概况,并对该技术未来发展趋势进行了展望。

ERIC-PCR方法鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌研究

本研究工作共收集食物样品6种62份,从中分离单核细胞增生性李斯特氏菌可疑菌落,用ERICPCR方法进行鉴定,并用国标生化方法验证.结果表明,两种鉴定方法结论完全一致.证明使用ERIC-PCR技术鉴定单核细胞增生性李斯特氏菌是可行的,并且耗时短、操作简单.

丁香精油对单核细胞增生性李斯特菌的抗菌性能及杀菌机制研究

近年来,食品安全问题已成为全球关注的公共卫生问题,食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因。单核细胞增生性李斯特菌(单增李斯特菌)因其高致病率的特点在食品等诸多领域给人类社会带来了严重的危害。本文着重研究了丁香精油对单增李斯特菌的抗菌效果及其抗菌机制。经试验测得,丁香精油对单增李斯特菌的最小抑菌浓度是0.05%,最小杀菌浓度是0.1%。0.05%的丁香精油能在8小时内清除99.996%的单增李斯特菌。实验结果表明,丁香精油对单增李斯特菌显示了较好的杀菌效果。丁香精油抗菌机制实验结果表明,丁香精油能破坏单增李斯特菌细胞的细胞膜,并且能抑制93.75%的ATP的合成。另外,丁香精油能有效抑制细菌核酸的合成,使细菌的生长繁殖受到影响,最终导致细菌死亡。

甘草多糖对单核细胞增生性李斯特菌体内外生长的影响

目的：探讨甘草多糖对单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）体内外生长的影响。方法：采用平板计数法和荧光显微镜、分光光度法及Bliss法分别分析甘草多糖对Lm生长速率和生物被膜形成的影响及计算细菌对小鼠半数致死量（median lethal dose,LD50）。观察低剂量（1 mg/kg）、中剂量（10 mg/kg）和高剂量（100 mg/kg）甘草多糖对感染100×LD50 Lm小鼠的保护力。小鼠感染0.01×LD50的Lm后1、7、14、21、28、35 d剖杀小鼠,检测脾脏、肝脏和肺脏中Lm分布的消长情况。结果：低质量浓度时（10、20、50μg/m L）,甘草多糖随着质量浓度增加对Lm标准菌株10403S生长速率和生物被膜形成的促进作用呈上升趋势;但高质量浓度时（100、200μg/m L）这种促进作用逐渐降低。Lm口服感染小鼠的LD50为2.70×10^8 CFU。高剂量甘草多糖对于100×LD50的Lm感染可提供50%的保护力。0.01×LD50的Lm感染小鼠,随着甘草多糖质量浓度增加小鼠脾脏、肝脏和肺脏的细菌量逐渐减少。结论：低质量浓度甘草多糖在体外对Lm的生长具有促进作用,但随着质量浓度增高促进强度逐渐降低,而甘草多糖可以提高小鼠抵抗Lm感染的能力。

产单核细胞增生性李斯特氏菌致病机制的研究进展

产单核细胞增生性李斯特氏菌是一类人畜共患的食源性致病菌。本文阐述了产单核细胞增生性李斯特氏菌的生物学特性、毒力因子及流行病学,旨在为产单核细胞增生性李斯特氏菌的致病机制提供理论依据。

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸(LNA),设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X+37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。

单核细胞增生性李斯特菌的主要毒力因子及其致病机理

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是重要的食源性人兽共患病原菌,LM的致病性与毒力因子密切相关,研究其毒力因子对于充分了解李斯特菌病的致病机制及有效防制该病有重要意义。作者对LM的毒力因子(如李斯特溶血素、肌动蛋白聚合蛋白、C型磷脂酶、内化素、细胞壁水解酶、酰胺酶及毒力调节因子如转录活化因子和应答调控因子等)和致病机理进行了综述。

深圳市食品中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况调查

目的了解深圳市食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的污染状况,并评价不同方法的检测效果。方法分别用传统分离培养方法和荧光PCR方法进行分离培养及检出鉴定。结果从178份样品中检出3份(株)单核细胞增生性李斯特氏菌,检出率为1.68%。结论深圳市食品中存在单核细胞增生性李斯特氏菌污染的危险,需加强食品中单核细胞增生性李斯特氏菌监测。用传统方法结合荧光PCR方法能提高单核细胞增生性李斯特氏菌的检出率和准确性。

四川省食品单核细胞增生性李斯特菌污染监测

目的检测四川省食品中单核细胞增生性李斯特菌的污染状况,初步确定污染高危食品,为食物中毒监测提供科学依据。方法用国标法检测,经VITEK32全自动微生物鉴定系统和APIlisteria试剂条鉴定。结果从461份9种食品中检出单增李斯特菌90株,总的污染率为19·5%,其中污染最严重的是冻禽类为47·5%,其次为水产品达42·5%。结论四川省食品中存在单增李斯特菌的污染,应加强相应的卫生监管力度。

食品工业中生物被膜态与浮游态单核细胞增生性李斯特菌的危害及其控制

单核细胞增生性李斯特菌是一种常见的、易引起食物中毒的重要食源性致病菌,常常会导致产品腐败和传染疾病,且易形成生物被膜,对食品工业有现时和潜在的危害。从浮游态与生物被膜态单核细胞增生性李斯特菌的差异及特点出发,就其对食品安全的危害原因及相应的控制方法与研究现状作一综述。

单核细胞增生性李斯特菌研究进展

单核细胞增生性李斯特菌是一种短小的革兰氏阳性无芽胞杆菌，是一种人畜共患病的致病菌，可使人和动物患李斯特菌病。李斯特菌属（1isteria）现在有2个群7个种，分别是单核细胞增生性李斯特菌（Lmonocytogenes，LM）（亦称产单核细胞李斯特菌）、伊氏李斯特（L．ivanovii）（亦称绵羊李斯特菌）、

单核细胞增生性李斯特氏菌种、株随机扩增DNA多态性研究

目的 分析单核细胞增生性李斯特氏菌种、株基因组DNA多态性 ,为其分型、鉴定提供理论依据。方法 应用随机扩增多态性DNA技术对李斯特氏菌基因组DNA进行扩增 ,根据DNA指纹图谱分析单核细胞增生性李斯特氏菌种、株的遗传多样性 ,同时构建相似性系数矩阵和树状图。结果 不同序列的随机引物扩增的RAPD图谱的多态性程度不同 ,其中单一引物P-7与复合引物P-1P-3 、P-4P-9扩增产生的指纹图谱对单核细胞增生性李斯特氏菌种、株均具有良好的区分能力。由该 3种引物扩增的RAPD图谱计算出的相似性系数矩阵及由此构建的聚类树状图均能得到李斯特氏菌的系统发育关系。结论 RAPD技术可用于李斯特氏菌的快速鉴定。

单核细胞增生性李斯特菌感染ICR小鼠模型的建立

单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种人畜共患食源性致病菌,能引起人和动物较为严重的感染症状。现广泛使用具有免疫活性的小鼠模型测定半数致死量(LD50)来评价不同LM菌株的致病性。为建立LM的ICR小鼠模型,本研究采用1/2a血清型的N21 LM菌株,分别以106、107、108、109和1010CFU的剂量口腔灌注感染6周龄ICR小鼠,每组10只;另取10只接种PBS作为对照组,测定LM对ICR小鼠的LD50;另取40只小鼠,平均分为2组,公母各半,以测定的LD50剂量接种LM,分别对各组小鼠临床症状、组织病理变化、体重变化及组织中细菌载量进行评价。结果发现,N21 LM菌株对ICR小鼠的LD50为109.25CFU;感染周期为10 d左右,感染小鼠出现被毛粗糙、精神萎靡、阴茎垂出及体重下降等临床症状。组织病理学分析结果显示,肝脏先后出现实质内灶状细菌团块、形成血栓、细胞坏死等;脾脏主要表现为白髓内淋巴细胞减少;肺脏主要表现为纤维素性肺炎。菌落计数和Real-time PCR的检测结果发现肝脏中细菌载量最高,脾脏次之。结果表明,ICR小鼠能作为单核细胞增生性李斯特菌的感染模型。本试验结果为研究LM的致病机制、疫苗研究及抗菌肽转基因小鼠抗LM的评价奠定了基础。