生鲜畜禽肉来源单核细胞性李斯特菌的基因组特征及其菌膜形成能力分析

目的:了解生鲜畜禽肉中典型单核细胞性李斯特菌遗传特征与其菌膜形成能力间的关系,为生鲜畜禽肉中该菌的精准防控提供依据。方法:依据前期分型结果,挑选生鲜畜禽肉来源的8种序列分型(sequence typing,ST)的10株单核细胞性李斯特菌分离株进行全基因组测序,对其进行基因功能注释、毒力基因鉴定、可移动遗传元件(前噬菌体、基因组岛、质粒)分析、进化分析和菌膜形成相关基因分析。然后,利用结晶紫染色法对分离株进行菌膜形成能力测定,分析不同类型分离株的基因组特征与其菌膜形成能力的相关性。结果:8种ST型单核细胞性李斯特菌分离株的基因组均鉴定到毒力岛LIPI-1、LIPI-2和其他19种以上的毒力基因,以及数量不等的前噬菌体和基因组岛;仅在ST3型分离株中鉴定到毒力岛LIPI-3基因,在ST8和ST1403型分离株中鉴定到质粒。进化分支系数显示,5种ST型分离株与数据库中疾病暴发菌株有较近的亲缘关系;此外,菌膜形成相关基因luxS和sigB分别在6种和7种ST型菌株中发生了突变;菌膜形成能力显示,ST1403和ST87型分离株的菌膜形成能力较强,ST1402型分离株能力最弱。结论:生鲜畜禽肉中含有多种致病潜力的单核细胞性李斯特菌,菌株可移动遗传元件的携带率可能与菌膜的形成能力相关。

单核细胞性李斯特菌基因dal的敲除及其生物学特性初步分析

在单核细胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)野生株EGDe act A及inl B双基因缺失株(EGDeΔact AΔinl B)的基础上,利用同源重组的方法进一步构建了缺失营养基因dal的菌株(EGDe Δact AΔinl BΔdal),并对该缺失菌株生长状态、毒力基因表达水平、生物被膜的形成量及细胞侵袭等方面作进一步分析。结果显示,37℃摇床培养6 h后,缺失株的菌浓度显著低于EGDe Δact AΔinl B(P<0.001),培养基中补充D-丙氨酸的缺失株生长速率与亲本株相比无显著差异;实时荧光定量聚合酶链式反应结果显示,缺失株的sig B基因表达水平变化最明显(P<0.01),约下调90%;缺失株生物被膜形成量显著增加(P<0.05),培养基补充D-丙氨酸后缺失株生物被膜的生成量与亲本株相比无差异;对Coca-2细胞的侵袭无影响,表明该基因对细菌生长能力及生物被膜形成具有重要的调控作用,并不影响菌株对细胞的侵袭力。此缺失株的构建为进一步研究基因dal的功能提供了理论支持。

三文鱼基质上单核细胞性李斯特菌毒力因子的表达

为了解单核细胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)污染食品基质后毒力因子表达的变化,本研究以Lm标准株ATCC 19115为研究对象,将其接种于三文鱼基质及胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂(tryptic soy agar-yeast extract,TSA-YE)(对照组)上,于0、4、7℃贮藏条件下分别培养24 h和48 h后,收集菌体提取总RNA,采用反转录实时定量聚合酶链式反应(reverse transcript-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)对其4个毒力因子hlyA、inlB、prfA、sigB的表达进行分析。结果表明,在0、4℃和7℃分别培养24 h和48 h后,4个主要毒力因子在三文鱼基质上的表达量均高于平板对照,其中hlyA在贮藏4℃的三文鱼基质上表达上调的最为显著。此外,prfA和sigB在4℃贮藏条件下,表达量极显著高于7℃和0℃(P<0.01);在不同的温度贮藏24 h,inlB和hlyA的表达量均表现为7℃>4℃>0℃(P<0.01);且4个主要毒力因子在三文鱼基质上的相对表达量均表现为48 h>24 h(P<0.01)。综上所述,本研究为该菌在食品基质上的风险评估和有效防控提供一定的理论依据。

失代偿性肝硬化合并单核细胞增多性李斯特菌脑膜炎患者抗感染治疗的药学监护

目的:分析1例失代偿性肝硬化合并单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)脑膜炎患者抗感染治疗的药学监护过程,为该类患者的抗感染治疗提供参考。方法与结果:临床药师在开展药学查房时发现,1例失代偿性肝硬化合并自发性细菌性腹膜炎患者在入院第2天中枢神经系统感染的相关症状,遂将抗感染治疗方案调整为美罗培南联合万古霉素,同时临床药师对抗感染治疗开展药学监护;入院第4天,患者脑脊液的宏基因组二代测序结果显示为LM,临床药师建议加用氨苄西林和庆大霉素(80 mg,q8h);入院第6天,患者的临床症状和相关指标明显改善,于是停用美罗培南和万古霉素,经过21 d治疗,患者好转出院。结论:诸如失代偿性肝硬化等严重基础疾病的患者发生感染时,临床药师利用自身专业特长协助医生制定合理的初始经验性抗感染治疗方案,不仅可以有效控制当前感染,还可以辅助判断后续感染的感染部位和可能病原菌,从而开展更有针对性的治疗和药学监护,以确保患者的治疗效果。

新型冠状病毒感染合并李斯特菌脑膜炎1例并文献复习

目的提高对新型冠状病毒及单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)脑膜炎的认识,增强临床医生对李斯特菌病的诊治水平。方法回顾性分析新型冠状病毒感染合并LM脑膜炎患者1例,并进行文献学习。结果患者女性,77岁,以发热、头痛起病,合并新型冠状病毒感染,通过脑脊液培养及血培养检查,确诊为LM脑膜炎,经过足量青霉素联合庆大霉素、后改为美罗培南抗感染治疗,临床症状缓解,病情得到有效控制。结论针对新型冠状病毒感染和免疫功能紊乱的患者,积极治疗基础病,改善机体免疫状态是关键,一旦确诊李斯特菌病,足量、足疗程应用敏感抗生素对改善预后至关重要。

携带新城疫病毒融合蛋白基因的重组减毒单核细胞增多性李斯特菌构建与鉴定

以鸡新城疫病毒F基因(NDV-F)为模式外源基因,通过基因切割-重叠延伸PCR法(SOE-PCR)将其插入到单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)毒力基因hly的启动子和信号肽序列下游,并将该融合片段克隆入穿梭质粒pKSV7,随后将重组质粒电转李斯特菌进行同源重组。NDV-F基因的PCR扩增表明该重组菌构建成功,RT-PCR结果表明F基因在重组菌中得到了转录。比较了重组菌和野生型菌株的溶血性、黏附和侵袭力、对小鼠和鸡胚的毒力和生长特性以及重组菌的体内外稳定性,结果表明:hly基因中F片段的整合消除了单核细胞增多性李斯特菌溶血素基因的表达,其培养上清液没有溶血性,而野生型菌株的溶血价达24;细胞试验表明重组菌对细胞的黏附力和相对侵袭力均有不同程度的降低,而相对侵袭力与野生型菌株具有显著性差异(P<0.05);重组菌对小鼠及鸡胚的毒力(LD50)与野生型相比分别下降3.7和6.5个对数数量级;重组菌在BHI肉汤和小鼠体内连续5次后,仍然可以扩增出目的基因NDV-F,初步表明该重组菌较为稳定。

鲜活农产品中单核细胞增多性李斯特菌快速检测技术的研究进展

单核细胞增多性李斯特菌是一种食源性致病菌,其引发的李斯特菌病致死率高达30%。本文综述了单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)的生物学特性和毒力因子,着重介绍了单核细胞增多性李斯特菌基于分子生物学、免疫学等技术的几种快速检测方法,旨在为单核细胞增多性李斯特菌的深入研究提供参考。

TaqMan探针法荧光定量PCR检测鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的研究

根据多条单核细胞增多性李斯特菌的hly基因序列,设计了1对简并引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR快速检测单核细胞增多性李斯特菌的方法,对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,并采用该法对染菌的鲜切甜瓜进行了检测。结果表明,该方法具有较好的特异性,对质粒标准品的灵敏度为1.12×102copies/μL,对染菌的鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的最低检出限为6.28×102cfu/mL。该方法可为快速检测鲜切果蔬病原微生物污染度及其控制奠定技术基础。

单核细胞增多性李斯特菌hlyA基因序列及溶血素活性测定

从3株不同来源的单核细胞增多性李斯特菌中PCR扩增溶血素编码基因hlyA,连接到T克隆载体转化到受体菌DH5α中,经菌落PCR和提取质粒酶切鉴定后测序,对测定的hlyA基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行分析,结果表明,从3个菌株克隆的hlyA基因具有完整的开放阅读框,同源性在96.9%以上;其推导的LLO氨基酸序列同源性在97.9%以上,N端存在相同的PEST基序,C端存在相同的保守性11肽结构。建立和运用分光光度法对3个试验菌株的溶血素活性进行了检测,结果表明,在pH5.6时LLO溶血活性最高,在pH7.0时LLO溶血活性基本丧失。本试验单核细胞增多性李斯特菌的流行病学分析和基因工程疫苗载体研究提供了依据。

重症单核细胞增多性李斯特菌脑膜脑炎1例

李斯特菌脑膜脑炎是单核细胞增多性李斯特菌(LM)引起的细菌性脑膜脑炎,通常发生于免疫功能低下者。LM是人畜共患致病菌,通过污染的食物传播。欧美国家报道较多,国内报道较少。李斯特菌脑膜脑炎病死率高,临床表现与其他细菌性脑膜炎类似。脑脊液检查与结核性脑膜炎亦难鉴别,确诊依赖于脑脊液涂片及培养。本文报道1例重症李斯特菌脑膜脑炎,患者为免疫力正常的菲律宾籍中年女性,急性起病,先后以病毒性脑膜脑炎及结核性脑膜炎治疗,病情进展快,发病3周出现呼吸衰竭,气管插管呼吸机辅助通气。脑脊液培养见LM后,予氨苄西林联合氨基糖苷类药物治疗3周,患者意识恢复,病情好转出院。本病例报道总结了李斯特菌脑膜脑炎的临床特点、危险因素及治疗转归。

非霍奇金淋巴瘤并发单核细胞增多性李斯特菌感染1例并文献复习

产单核细胞李斯特菌(LM)是一种较罕见的病原体,常经食物传播,人摄入后引发感染,称为李斯特菌病.李斯特菌感染多发生于新生儿、老年人、肿瘤患者等免疫低下人群,临床表现多样,包括发热、嗜睡、呕吐、腹泻等症状,感染后病死率可高达30%[1],故及时做细菌学检查以指导治疗尤为重要.本研究对1例复发难治的非霍奇金淋巴瘤患者LM感染的临床病例资料进行分析,并进行文献复习,旨在加强临床对该病的认识和重视,以便提高诊断治疗该病的能力.现将研究报告报道如下.

荧光定量PCR监测单核细胞增多性李斯特菌研究

目的 探索一种快速、敏感、特异的单核细胞增多性李斯特菌检验方法。方法 以单核细胞增多性李斯特菌hly A基因作为靶序列设计一对引物,并以标准单核细胞增多性李斯特菌菌株中提取的DNA作为模板,用常规PCR和荧光定量PCR对单核细胞增多性李斯特菌进行监测与鉴定。结果 含有一段特征基因的6 0 0 bp片段,具有良好的单核细胞增多性李斯特菌检测特异性。结论 荧光定量PCR比普通PCR具有特异性强、灵敏度高、重现性好。可以定量、快捷的应用于监测检验单核细胞增多性李斯特菌。

单核细胞增多性李斯特菌LIPI-1全基因克隆与序列分析

参考GenBank中单核细胞增多性李斯特菌(LM)第I毒力岛(LIPI-1)有关基因序列设计引物,分段扩增、克隆了分离菌株XFL0605LIPI-1毒力岛全基因序列,序列全长8 558 bp,包括完整的prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB6个基因。对LIPI-1编码的6个毒力基因进行序列分析,各毒力基因反映的进化关系不尽一致,表明李斯特菌株在获得外源性毒力基因方面具有不同步性,各毒力基因来源也不尽相同。应用相应软件对各毒力基因编码蛋白的信号肽、跨膜区进行预测,确定了基因序列中调控蛋白PrfA结合区核苷酸序列。分析并确认了hlyA基因及推导氨基酸序列PEST基序和C端保守11肽序列。研究还发现LM菌株XFL0605actA基因编码604个氨基酸,缺失了105 bp富脯氨酸重复片段编码碱基,只有2个E/DFPPPPXD/E重复序列。

PCR方法检测单核细胞增多性李斯特菌的实验研究

目的建立一种快速、简便、准确,适合于基层应用的检测鉴定Lm的方法。方法选取iap基因作为靶序列设计一对引物,用该引物对4株标准株及4株无关菌进行PCR扩增,得到进一步验证。采用PCR和常规方法同时对人工感染的牛奶进行检测鉴定。结果4株标准株获得了预期700bp左右的扩增片段,而同属的L.welshimeri、L.grayi、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均没有这一特异性条带。检测人工感染牛奶20份,检出率为90%,高于传统分离培养法(60%)。结论建立的PCR法可用于单增李斯特氏菌的快速、特异、敏感诊断。

单核细胞增多性李斯特菌对小鼠血脑屏障通透性的影响

为研究小鼠感染单核细胞增多性李斯特菌(LM)90SB2株后血脑屏障通透性的变化,本实验采用ELISA方法检测小鼠血清中髓鞘碱性蛋白(MBP)的水平和甲酰胺-紫外分光光度法检测脑组织中伊文思蓝(EB)的含量。结果显示:MBP于感染后4 h开始升高,10 h后维持较高水平,10 h、24 h、48 h、120 h和144 h各时间点与对照组比较均有显著性差异(p<0.05);EB在感染后24 h之内无明显增加,24 h后有较大幅度升高,并且与对照组比较存在显著性差异(p<0.05);但72 h后开始缓慢下降。表明小鼠感染LM后会导致血脑屏障通透性一定程度的升高。

重组减毒单核细胞增多性李斯特菌作为疫苗载体在抗肿瘤中的研究进展

将细菌疫苗用于肿瘤的治疗和预防已取得多方面的进展,单核细胞增多性李斯特菌(LM)能在专职吞噬细胞和非专职吞噬细胞内生存繁殖,可同时引起机体的细胞免疫和体液免疫。将外源性肿瘤特异性抗原导入减毒LM,可以显著诱导抗肿瘤的细胞免疫应答,是非常有效的疫苗载体。文章主要从具有胞内茵特殊优势的单核细胞增多性李斯特菌的生物学特性、做为抗肿瘤疫苗载体的优点等方面的研究进展进行了阐述。

单核细胞增生性李斯特氏菌hly基因的克隆表达

以单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria Monocytogengs,LMO)LMO-0586基因组DNA为模板,运用PCR扩增得到片段大小为1 646bp的致病基因李氏溶血素(hly)基因,并克隆到pMD18-T载体上,构建克隆载体pMD18-T-hly。经测序正确后,将hly基因克隆至表达载体pGEX上构建表达质粒pGEX-6P-1-hly。在IPTG诱导下,携带pGEX-6P-1-hlyA的E.coli BL21(DE3)高效表达分子量约为82KDa的可溶性蛋白及包涵体形式的蛋白。为进一步研究溶血素蛋白的结构、功能,LMO的分子流行病学调查、诊断试剂盒的开发提供依据。