HL60-IL6单核细胞活化反应法在注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原检测中的应用研究

目的:探讨HL60-IL6单核细胞活化反应法在注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原检测中的应用。方法:参照2015年版中国药典通则1193,确定注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原测定限值及最小有效稀释浓度。采用细胞增殖抑制试验、IL-6 ELISA试剂盒干扰试验和热原干扰试验分别探讨对HL60细胞生长、对IL-6和热原测定无影响的供试品浓度,进而确定适用于注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ体外热原测定的HL60-IL6方法。用该方法对1个厂家7批注射用肝水解肽、1个厂家6批注射用辅酶Ⅰ进行热原测定。结果:注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ最小有效稀释浓度分别为0.003 mg·ml^-1和0.0002 mg·ml^-1;对HL60细胞增殖无影响的最高浓度分别为1 mg·ml^-1和10 mg·ml^-1,对IL-6和热原测定无影响的最高浓度均为0.1 mg·ml^-1。根据以上实验结果确定了适合该方法的注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ浓度均为0.1 mg·ml^-1。用该方法对1个厂家7批注射用肝水解肽、1个厂家6批注射用辅酶Ⅰ供试品进行热原测定,结果均为阴性。结论:HL60-IL6方法适用于注射用肝水解肽和注射用辅酶Ⅰ热原测定。

首批单核细胞活化反应检查法专用细菌内毒素国家标准品的建立与应用

目的 为《中华人民共和国药典》(2020年版)9301单核细胞活化反应检查法建立专用的细菌内毒素国家标准品,保障注射剂的质量安全。方法 通过生产制备、协作标定、均匀性考察等研究,建立了首批细菌内毒素国家标准品(单核细胞活化反应检查法专用)。结果 全国5家药品检验所使用3种方法进行协作标定,标定结果间经方差分析无显著性差异,加权平均值为每支152.0 EU,95%置信区间为每支136.2~169.5.0 EU,可信限率为10.96%。均匀性研究符合规定。待标品使用单核细胞活化反应检查法检测结果平均值为每支144.6 EU。最终确定待标品为细菌内毒素国家标准品(单核细胞活化反应测定用),效价为每支150 EU。结论 建立了首批细菌内毒素国家标准品(单核细胞活化反应检查法用,批号:150608-202101)。

单核细胞趋化蛋白-1和调节活化正常T细胞表达分泌因子与实验性变态反应性神经炎的关系

目的研究趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和调节活化正常T细胞表达分泌因子(RANTES)与实验性变态反应性神经炎(EAN)发病的关系,探讨EAN的免疫发病机制.方法给Wistar大鼠足垫皮下注射兔坐骨神经匀浆建立EAN模型,用免疫组化技术检测EAN大鼠发病不同时间坐骨神经MCP-1和RANTES的表达.结果EAN组的MCP-1表达第9 d达高峰,随后逐渐下降,第15 d、21 d、28 dMCP-1的表达与前一时间点比较差异均有显著性(均P＜0.01);第9 d、15 d、21 d MCP-1表达均显著高于对照组(均P＜0.001).EAN组第9 d、15 d、21d RANTES表达均显著高于对照组(P＜0.01～0.001),第15 d表达最高.结论MCP-1和RANTES在EAN的发病过程中发挥了重要作用,MCP-1可能起始动作用,RANTES可能与EAN的病情进展有关.

PCR方法检测单核细胞增多性李斯特菌的实验研究

目的建立一种快速、简便、准确,适合于基层应用的检测鉴定Lm的方法。方法选取iap基因作为靶序列设计一对引物,用该引物对4株标准株及4株无关菌进行PCR扩增,得到进一步验证。采用PCR和常规方法同时对人工感染的牛奶进行检测鉴定。结果4株标准株获得了预期700bp左右的扩增片段,而同属的L.welshimeri、L.grayi、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均没有这一特异性条带。检测人工感染牛奶20份,检出率为90%,高于传统分离培养法(60%)。结论建立的PCR法可用于单增李斯特氏菌的快速、特异、敏感诊断。

CRP和LPS致正常人外周血单核细胞NF-κB活化及IL-6合成的比较

目的 :观察C -反应蛋白 (CRP)和脂多糖 (LPS)诱导人外周血单核细胞合成白细胞介素 - 6水平及两者致单核细胞NF -κB活化的程度 ,比较其致炎作用。方法 :Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单核细胞 ,应用酶联免疫吸附试验 (ELISA)法观察CRP和LPS刺激单核细胞产生IL - 6的时间效应 ,比较其峰值。免疫细胞化学观察两者致单核细胞NF -κB活化的程度。结果 :CRP和LPS刺激IL - 6合成开始的时间分别是 4小时和 2小时 ,呈时间依赖性 ,在 2 4小时达高峰。LPS组峰值高于CRP组。在刺激 1 6小时后 ,LPS组NF -κB活化的程度高于CRP组。结论 :CRP和LPS均能活化NF -κB ,并诱导单核细胞产生IL - 6 ;1 0ng/mlLPS的致炎作用强于 2 0ug/mlCRP。

白藜芦醇预处理对星形胶质细胞氧糖剥夺/再复氧损伤后活化及炎症反应的影响

目的探讨白藜芦醇预处理对体外氧糖剥夺/再复氧(OGD/R)损伤后星形胶质细胞活化及炎症反应的影响。方法征集20只新生SD大鼠(生后24 h内),将其原代分离培养的大脑皮层星形胶质细胞行氧糖剥夺150 min,再复氧培养24 h。实验分为正常组(Nor)、对照组(Ctrl)和白藜芦醇预处理组(Res)。CCK-8法检测细胞活力,5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法检测细胞增殖,免疫荧光染色法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、S100β蛋白表达,Western blotting检测GFAP、S100β、波形蛋白(vimentin)、白细胞介素(IL)-10、β干扰素(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-1β蛋白表达,ELISA法检测IL-10、IFN-β、TNF-α和IL-1β蛋白含量。结果CCK-8法检测结果显示,随着白藜芦醇浓度(5、20、40μmol/L)的增高,细胞活力逐渐增高,且与对照组差异有显著性(P<0.01),以40μmol/L组细胞活力最强。之后随白藜芦醇浓度(80、100μmol/L)的增高,细胞活力显著降低,以100μmol/L组细胞活力最弱(P<0.05)。EdU检测显示,在OGD/R损伤后,对照组和白藜芦醇组显著高于正常组EdU阳性细胞比例(P<0.01),而白藜芦醇组显著低于对照组(P<0.01)。免疫荧光染色、Western blotting和ELISA法显示,对照组和白藜芦醇组GFAP、S100β、vimentin、IL-10、IFN-β、TNF-α和IL-1β蛋白表达或含量显著高于正常组(P<0.05),但白藜芦醇组除IL-10和IFN-β蛋白表达或含量较对照组增高外,其余均低于对照组(P<0.05)。结论白藜芦醇预处理可抑制OGD/R后体外星形胶质细胞的活化,并减轻炎症反应。

自动红细胞沉降率分析仪与传统魏氏法测定红细胞沉降率的对比观察

红细胞沉降率（ESR）是临床常用的监测炎性反应的可靠指标。1993年,国际血液学标准化委员会（ICSH）将魏氏法推荐为测定ESR的标准方法,但对其操作者和环境的生物危害性较大,检测时间长,给操作者和患者带来诸多不便。近年来，国内外各种型号的自动ESR仪因克服了传统魏氏法的诸多不便而进入临床实验室。

快速法测定C-反应蛋白对儿科感染性疾病诊断的意义

目的 用快速法测定小儿C-反应蛋白(CRP)值，鉴别诊断细菌、支原体和病毒感染。方法 采集末梢血，用快速CRP分析仪测定CRP值和用全自动血球计数仪测定白细胞(WBC)。结果 细菌感染CRP阳性率为100％，CRP值均>8mg／L；病毒感染CRP阳性率为19％，CRP值基本<8mg／L；支原体感染CRP阳性率为34．1％，阳性平均值为32．7mg／L。在细菌感染病例中有。73％以上WBC值升高，非细菌感染疾病WBC平均值为正常。结论 CRP对儿科感染性疾病有重要的诊断价值，在鉴别细菌和病毒感染方面比WBC更敏感。

淋巴细胞酸性α—萘乙酸脂酶活性(ANAE)测定法的改进

本文对ANAE测定法作了改进,减去了分离淋巴细胞,固定涂片等步骤,用外周血常规涂片即可测定,不需特殊仪器及试剂,适用于基层医院。并对60名儿童和70名战士进行了ANAE测定,结果满意,提示儿童的ANAE较成人低,说明儿童的细胞免疫功能不及成年人,也是儿童易患疾病传染的原因之一。

C57BL/6小鼠骨髓单核细胞分离、培养、纯化及向破骨细胞的分化

背景:目前骨髓单核细胞的分离提取国内外文献报道,大多是利用RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞。目的:探讨分离、培养、纯化和鉴定C57BL/6小鼠骨髓单核细胞的方法,观察小鼠骨髓单核细胞体外生长特征,诱导其向破骨细胞分化。方法:无菌分离C57BL/6小鼠股骨和胫骨,取出骨髓细胞,提取过程中先用红细胞裂解液去除红细胞;骨髓细胞过夜培养后(大于16 h),第2天分离出悬浮细胞,在含有巨噬细胞集落刺激因子的培养基中继续培养获得贴壁的小鼠骨髓单核细胞。通过换液对小鼠骨髓单核细胞进行纯化和扩增培养。进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测原代小鼠骨髓单核细胞细胞表面抗原,加入巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配基诱导分化为破骨细胞。结果与结论:新分离的小鼠骨髓单核细胞呈小圆形,两端伸出触角,培养5 d后,细胞成椭圆形,两端的触角更明显,增殖依赖巨噬细胞集落刺激因子。流式结果显示分离的小鼠骨髓单核细胞纯度较高,能够诱导分化为破骨细胞。利用间充质干细胞与单核细胞的贴壁能力不同及巨噬细胞集落刺激因子显著促进单核细胞贴壁增殖的特性能有效分离获得稳定生长的小鼠骨髓单核细胞。培养的小鼠骨髓单核细胞性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究。

高血脂血瘀模型白细胞粘附活化和白细胞介素2、6和8的变化

建立高脂、免疫损伤、应激等综合因素所致高血脂血瘀动物模型 ,探讨动脉粥样硬化相关免疫损伤和炎症反应机制。将 4 0只Wistar大鼠随机分成高脂组、免疫损伤高脂组 (异体血清蛋白和高脂 )、免疫损伤应激高脂组(高脂、异体血清蛋白和肾上腺素 )和应激组 (单纯肾上腺素 )。观察不同模型脂质代谢、白细胞粘附活化及白细胞介质的变化。结果发现 ,和应激组比较 ,高脂组、免疫损伤高脂组和免疫损伤应激高脂组总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平明显升高 ,免疫损伤高脂组和免疫损伤应激高脂组脂蛋白 (a)水平明显升高 ,尤其是免疫损伤应激高脂组甘油三酯水平升高更显著 (P <0 .0 5和P <0 .0 1) ,高脂组、免疫损伤高脂组和免疫损伤应激高脂组白细胞介素 6水平明显升高 ,高脂组和免疫损伤高脂组白细胞介素 8水平明显升高 (P <0 .0 1) ;应激组白细胞粘附分子CD11/CD18表达率明显高于其他三组 (P <0 .0 5 ) ;各组间白细胞介素 2水平无显著差异。结果提示 ,高脂、免疫损伤、应激等综合因素所致高血脂血瘀模型 ,为中医药多环节干预动脉粥样硬化和血瘀证的作用研究提供了一个较为可靠的模型 ,同时初步阐明了免疫损伤、炎症反应机制在动脉粥样硬化发病机理中的重要作用 。

溶菌酶的活性测定方法

溶菌酶是一种与单核 -巨噬细胞系统有关的非特异防御机制 ,参与机体的免疫作用 ,测定溶菌酶活性值日益受到临床重视。国内外目前采用比浊法 ,琼脂板扩散法 ,比色测定法 ,琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法。前两种方法较为常用 ,但干扰因素多 ,实验结果的重现性差 ;比色法操作简单但误差较大。以琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法的测定效果最为理想。

实时荧光定量测定人B细胞激活因子受体-BCMA基因表达水平

目的:研究建立实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测人B细胞激活因子受体-BCMA含量的方法,及探讨其外周血单个核细胞(PBM C)中BCMA mRNA表达的检测价值。方法:在BCMA基因高保守区设计特异性引物和荧光探针,用逆转录-PCR扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BCMA mRNA含量,并以BCMA mRNA和2βM mRNA含量的比值进行BCMA表达水平评价。结果:RFQ-PCR检测BCMA含量的线性范围为109pg/m l^101pg/m l,低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为13.5%和11.2%,高浓度样本批内和批间CV分别为8.9%和9.7%。30例健康献血员样本的PBM C中,90%(27例)检出有BCMA mRNA表达,范围为0.10~0.98。结论:RFQ-PCR检测BCMA mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性。

甲基紫电极EDTA电位滴定法测定微量铅

提出了在氨三乙酸(NTA,活化剂)存在下,以Mn 催化高碘酸钾氧化甲基紫的反应指示滴定终点,以自制的甲基紫选择性电极为指示电极,Mn 为滴定剂,EDTA为阻抑剂,催化电位滴定法测定微量铅的新方法。实验表明,选择1 0×10-3mol/L甲基紫溶液、5 0×10-3mol/LKIO4溶液和5 0×10-3mol/LNTA溶液用量分别为0 50,1 00,0 50mL,滴定速度1 7mL/min,终点灵敏,准确度高。将该方法用于蓄电池废水中铅含量测定,结果与火焰原子吸收光谱法一致,样品平均回收率为99 1%,RSD为1 47%。

普伐他汀对人单核细胞源树突状细胞免疫功能的影响

目的探讨普伐他汀对在免疫调控中起重要作用的人单核细胞源树突状细胞(DC)免疫功能的影响.方法采用免疫磁珠法分离人外周血CD14+单核细胞,经含重组粒细胞-巨噬细胞刺激因子(100 ng/ml)和重组白介素(rhIL)-4(20 ng/ml)的Cellgro培养,使其分化为DC.DC与50～100 μmol/L普伐他汀孵育72 h后,采用流式细胞术检测DC表型(CD1a、CD40、CD86、HLA-DR),混合T淋巴细胞反应检测DC对淋巴细胞增殖的影响,采用酶联免疫吸附试验法检测细胞培养上清液中Th1/Th2 [白介素(IL)-12、干扰素(IFN)-γ/ IL-2、IL-10]细胞因子的浓度.结果与对照组相比,经普伐他汀处理的DC可下调CD80、CD86、 HLA-DR和CD1a的表达,对T淋巴细胞增殖作用明显减弱,明显抑制DC Th1细胞因子IL-12和IFN-γ的分泌(P<0.05),但对Th2细胞因子IL-2 和IL-10水平无明显影响.100 μmol/L甲羟戊酸可逆转普伐他汀的作用.结论普伐他汀可明显抑制DC的成熟和免疫活性,此作用与甲羟戊酸途径有关.这可能是他汀类药物免疫调节的新机制.

催化动力学光度法测定痕量铁的研究

研究在稀硫酸介质中,Fe(Ⅲ)催化过氧化氢氧化亚甲蓝褪色反应的适宜条件与动力学性质,建立了催化动力学光度法测定痕量铁的新方法.用固定时间法在645nm处监测催化反应,线性范围为0.044～40.0μg·L-1,检出限0.037μg·L-1,反应的表观速率常量为1.13×10-3s-1,表观活化能为93.3kJ·mol-1.本方法应用于农产品和蒙药样品中痕量铁的测定,相对标准偏差1.3%～4.0%,结果较为满意.

miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子基因表达的靶向调控作用

目的探讨miR-9对人胃癌细胞株活化白细胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule,ALCAM)基因表达的靶向调控作用。方法运用生物信息学方法预测靶向调控ALCAM的miRNA;应用SYBR Green荧光定量PCR检测各个人胃癌细胞株中ALCAM mRNA的表达情况,确定实验细胞株;通过PCR扩增合成含有miR-9结合位点的ALCAM mRNA 3'端非编码区(ALCAM 3'UTR)片段和在miR-9结合位点进行突变的ALCAM-mut mRNA 3'UTR,测序鉴定后将其克隆至报告基因载体psi CHECK-2质粒,分别命名为psi CHECK-2-ALCAM和psi CHECK-2-ALCAM-mut;分组转染重组质粒和miRNA,双荧光素酶报告基因系统检测各实验组中细胞荧光素酶的表达,SYBR Green荧光定量PCR和Western blotting检测ALCAM mRNA及蛋白表达水平。结果生物信息学分析筛选发现miR-9可能靶向调控ALCAM; ALCAM mRNA在各胃癌细胞株中的表达量明显高于人正常胃黏膜GES-1细胞株,且SGC-7901细胞株ALCAM mRNA的表达量最高(P <0. 05),确定为实验细胞株;测序验证ALCAM 3'UTR和ALCAM-mut3'UTR经PCR扩增合成成功; psi CHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-9 mimics细胞组的相对荧光素酶活性较psi CHECK-2-ALCAM质粒共转染miR-NC、miR-9 inhibitor细胞组或空白对照组明显降低(P <0. 05),且该组细胞ALCAM mRNA和蛋白的表达明显降低(P <0. 05);而psi CHECK-2-ALCAM-mut质粒共转染miR-NC、miR-9 mimics或miR-9 inhibitor细胞组的相对荧光素酶活性与空白对照组相比,差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论在SGC-7901中,miR-9通过与ALCAM mRNA 3'UTR结合而负性调控ALCAM基因的表达。

摇床吸附法微量细胞板短期培养快速检测流感病毒

目的:为在流感样疫情的调查中能够快速准确地查清流感病原,提高公共卫生突发性应急事件的快速反应能力。方法:摇床吸附微量细胞板短期培养法的荧光抗体染色用于快速检测流感病毒并与常规的病毒分离方法作比较。结果:对83份流感疑似病人含漱液的快速检测结果与常规的细胞培养法病毒分离结果相比较,在病毒分离阳性的45份标本中,快速检测法也有34份阳性,阳性符合率为75%,敏感性测定达到了能够检测出0 01个血凝单位浓度的流感病毒。结论:微量细胞板荧光染色法检测流感病毒的敏感性要优于一般市售的快速诊断试剂盒。检测时间约在24h内,达到了快速准确的目的。

糖皮质激素对哮喘患者血清白介素-16和单核细胞趋化蛋白-4浓度的影响

目的探讨口服泼尼松对过敏性哮喘患者血清白介素-16(IL-16)和单核细胞趋化蛋白-4(MCP-4)浓度的影响。方法25例患者按照随机、双盲法分成泼尼松组13例,安慰剂12例,分别口服泼尼松30mg/d及安慰剂。在治疗前及治疗2周后抽取外周静脉血,用夹心酶联免疫吸附法测定血清IL-16及MCP-4浓度。结果泼尼松组治疗2周后血清IL-16及MCP-4浓度分别为(371.5±45.5)ng/L和(330.2±41.3)ng/L,显著低于治疗前的(544.1±60.5)ng/L和(455.9±48.8)ng/L,P均<0.01。而安慰剂组治疗前后血清IL-16及MCP-4的浓度无明显变化。结论过敏性哮喘患者给予短期口服糖皮质激素可以明显降低血清中IL-16及MCP-4的浓度。

脐带间质干细胞移植治疗对MRL/lpr狼疮鼠单核细胞趋化蛋白-1的影响

目的:探讨脐带间质干细胞(UC-MSCs)治疗MRL/lpr狼疮鼠的作用机制。方法:24只MRL/lpr鼠随机分为UC-MSCs1次移植治疗组(G1)、UC-MSCs3次移植治疗组(G2)、对照组(G3)。酶联免疫吸附法检测血清和尿液单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)水平,蛋白印迹法检测肾脏MCP-1蛋白水平的表达,实时定量PCR检测肾脏MCP-1基因mRNA表达,免疫组化检测MCP-1蛋白在肾脏表达。结果:(1)29周时G2组血液MCP-1水平为827.70±259.36pg/mL,显著低于G3组1 325.45±352.28pg/mL(P<0.05);28周时G2组尿液MCP-1为239.93±31.47pg/mL,显著低于对照483.52±184.37 pg/mL(P<0.01)。(2)G2组(0.30±0.02)和G1组(0.40±0.02)MCP-1蛋白表达与G3(0.67±0.05)组比较差异有统计学意义(P<0.01);G2组也显著低于G1组(P<0.05)。(3)G2组(0.30±0.01)和G1组(0.39±0.02)MCP-1基因mRNA表达显著低于对照组(0.79±0.15)(P<0.05),G2组显著低于G1组(P<0.05)。(4)MRL/lpr鼠MCP-1主要定位于肾小球系膜区和肾间质炎性细胞浸润处及肾小管。G3组肾小球系膜区强表达MCP-1,治疗G1、G2组表达明显减弱。结论:UC-MSCs可能通过抑制MCP-1表达而发挥治疗作用。