C57BL/6小鼠骨髓单核细胞分离、培养、纯化及向破骨细胞的分化

背景:目前骨髓单核细胞的分离提取国内外文献报道,大多是利用RAW264.7细胞诱导分化为破骨细胞。目的:探讨分离、培养、纯化和鉴定C57BL/6小鼠骨髓单核细胞的方法,观察小鼠骨髓单核细胞体外生长特征,诱导其向破骨细胞分化。方法:无菌分离C57BL/6小鼠股骨和胫骨,取出骨髓细胞,提取过程中先用红细胞裂解液去除红细胞;骨髓细胞过夜培养后(大于16 h),第2天分离出悬浮细胞,在含有巨噬细胞集落刺激因子的培养基中继续培养获得贴壁的小鼠骨髓单核细胞。通过换液对小鼠骨髓单核细胞进行纯化和扩增培养。进行形态学观察,测定生长曲线,用流式细胞仪检测原代小鼠骨髓单核细胞细胞表面抗原,加入巨噬细胞集落刺激因子和核因子κB受体活化因子配基诱导分化为破骨细胞。结果与结论:新分离的小鼠骨髓单核细胞呈小圆形,两端伸出触角,培养5 d后,细胞成椭圆形,两端的触角更明显,增殖依赖巨噬细胞集落刺激因子。流式结果显示分离的小鼠骨髓单核细胞纯度较高,能够诱导分化为破骨细胞。利用间充质干细胞与单核细胞的贴壁能力不同及巨噬细胞集落刺激因子显著促进单核细胞贴壁增殖的特性能有效分离获得稳定生长的小鼠骨髓单核细胞。培养的小鼠骨髓单核细胞性状稳定,表型稳定均一,适于做进一步研究。

富含CpG的脱氧核苷酸片段对破骨细胞形成的调节作用

目的 :研究富含CpG的脱氧核苷酸片段 (ODN)调节破骨细胞 (OC)的形成 .方法 :分离小白鼠骨髓单核细胞 ,单纯骨髓单核细胞或骨髓单核细胞分别与 30 μg/L CSF ;30 μg/L CSF ,2 0 μg/LRANKL ;30 μg/LM CSF以及不同浓度ODN共同培养 1～ 4d .结果 :ODN可以诱导骨髓单核细胞分化为TRAP阳性的破骨细胞 ,这些细胞表达降钙素受体 .Northernblot显示 :随着ODN浓度由 5nmol/L增加至 1 0 0nmol/L ,细胞TNF αmRNA表达量也随之增加 ;骨髓单核细胞与 30 μg/LM CSF ,2 0nmol/LODN 1 82 6共同培养 1 ,2 ,3和 4d ,同样显示随着时间延长 ,细胞TNF α表达也逐渐增加 .结论 :ODN可以刺激破骨细胞的转化 ,为临床骨疾病的治疗开辟了一个新途径 .