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单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究
被引量:
1
1
作者
范三红
单丽伟
+2 位作者
王保莉
管楚枤
郭蔼光
《生物化学与生物物理进展》
SCIE
CAS
CSCD
北大核心
2010年第4期426-432,共7页
T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和Hi...
T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7EⅠ突变体,MBP-T7EⅠ(E20K)和His6-T7EⅠ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7EⅠ异源二聚体(T7EⅠ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7EⅠ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7EⅠ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7EⅠ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0~6.0mol/L尿素或1.75~2.0mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7EⅠ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略,同时提供了一种简便直观的蛋白质二聚体稳定性测试方法.
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关键词
T7核酸酶Ⅰ
结构域
交换
单活性结构域
二聚体稳定性
催化特性
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职称材料
题名
单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究
被引量:
1
1
作者
范三红
单丽伟
王保莉
管楚枤
郭蔼光
机构
西北农林科技大学生命科学学院
西北农林科技大学陕西省农业分子生物学重点实验室
New England Biolabs Inc.
出处
《生物化学与生物物理进展》
SCIE
CAS
CSCD
北大核心
2010年第4期426-432,共7页
基金
西北农林科技大学青年学术骨干支持计划(QN2009070)资助项目~~
文摘
T7核酸酶Ⅰ(T7EⅠ)是一种能特异识别并拆分重组中间体Holliday Junction(HJ)的多功能核酸酶,该酶不仅能特异识别和拆分HJ,而且能随机切刻双链DNA,特异识别并切割双链DNA中的切刻和单碱基错配位点.构建了两种原核表达载体用于表达MBP和His-tag融合的两种T7EⅠ突变体,MBP-T7EⅠ(E20K)和His6-T7EⅠ(E65K).每一种融合蛋白形成的同源二聚体不具有核酸酶活性,通过共表达或两种蛋白质共变性复性、双标签亲和纯化,最终获得具有单个活性结构域的T7EⅠ异源二聚体(T7EⅠ-SAD).以pUC(AT)和pUC19为底物测试T7EⅠ-SAD的HJ拆分活性、随机切刻活性和切刻位点切割活性,结果显示,T7EⅠ-SAD可特异识别并切刻HJ结构,但丧失了同时引入两个切刻位点的能力,其对pUC(AT)的特异切刻活力和对pUC19的随机切刻活力与野生酶相当.逐级变性梯度洗脱实验显示,T7EⅠ-SAD的稳定性与野生型酶接近,二聚体解离需要5.0~6.0mol/L尿素或1.75~2.0mol/L盐酸胍;凝胶阻滞实验表明T7EⅠ-SAD具备与HJ结构特异结合的能力.为具有细胞毒性蛋白的表达提供了一种新策略,同时提供了一种简便直观的蛋白质二聚体稳定性测试方法.
关键词
T7核酸酶Ⅰ
结构域
交换
单活性结构域
二聚体稳定性
催化特性
Keywords
T7 endonucleaseⅠ
domain swapping
single active domain
dimer stability
catalytic properties
分类号
Q55 [生物学—生物化学]
下载PDF
职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
单活性结构域T7核酸酶Ⅰ的制备及性质研究
范三红
单丽伟
王保莉
管楚枤
郭蔼光
《生物化学与生物物理进展》
SCIE
CAS
CSCD
北大核心
2010
1
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职称材料
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