基于GBS测序的3个野生单环刺螠群体遗传多样性和群体结构分析

【目的】旨在评估我国野生单环刺螠群体的遗传多样性和群体结构。【方法】采集大连、唐山、烟台3个群体样本,利用GBS测序技术获取SNP标记位点信息,分别对其期望杂合度、观测杂合度、核苷酸多样性、分子方差、聚类及群体结构等进行分析。【结果】3个野生单环刺螠群体观测杂合度为0.212~0.223,期望杂合度为0.239~0.257;核苷酸多样性在0.252~0.271之间。遗传变异主要来源于单环刺螠群体内部。3个自然群体可分成2个遗传群体,样本未根据地理位置表现出明显的群体结构。【结论】我国野生单环刺螠具有中等遗传多样性。

单环刺螠(Urechis unicinctus)刚毛结构与成分分析

单环刺螠(Urechis unicinctus)具有腹刚毛和尾刚毛。为探究单环刺螠刚毛结构与成分,本文采用扫描电镜对其刚毛的内外形态进行了观察;利用傅里叶红外光谱、X-射线衍射分析了其主要成分;基于现有的转录组数据分析了与其代谢相关的基因种类和潜在通路;初步分析了刚毛结构特点与其年龄的关系。结果表明,单环刺螠一般具有2根腹刚毛,8~13根尾刚毛;腹刚毛细长,弧度较大;尾刚毛粗短,弧度平缓;随年龄增长,刚毛长度和直径均有所增加;且年龄越大,刚毛表面的结节状特征越为明显。刚毛由直径约1μm的微纤维组成,呈倾斜的层状结构纵向排列,每层平均宽度为(172±27)μm;成分分析发现其主要由α-几丁质构成,还含有蛋白质成分。通过生物信息学分析发现单环刺螠体内存在与几丁质代谢相关酶,并推测了其潜在的代谢通路;研究结果为判断单环刺螠的年龄及生长状态提供了一定的理论基础。

水温对单环刺螠幼体和成体滤水及呼吸代谢特征的影响

为探究温度对单环刺螠生理活动的影响,分别以单环刺螠幼体和成体为研究对象,对其在不同水温(17℃、25℃和30℃)下的滤水率、耗氧率和排氨率进行了检测。试验结果显示:在试验温度范围内,单环刺螠幼体和成体的滤水率均随着水温的升高而降低,而相同温度下幼体的滤水率极显著高于成体(P<0.001);水温30℃下幼体和成体的排氨率分别显著高于其他两个温度组(P<0.05),但在相同温度下,幼体与成体之间排氨率无显著差异(P>0.05);水温30℃组幼体的耗氧率显著高于其他两个温度组,不同温度组之间成体的耗氧率则无显著差异(P>0.05),而水温17℃、30℃下幼体的耗氧率极显著高于成体(P<0.01、P<0.001);幼体O/N值(呼吸的氧原子数与排出的氨态氮原子数比值)随着水温的升高而降低,成体O/N值则是先升高后降低,提示在试验水温范围内,单环刺螠主要供能物质是蛋白质。结果表明,单环刺螠是一种高滤水、低耗氧型生物,温度和体质量对单环刺螠滤水和呼吸代谢具有显著影响。

莱州湾单环刺螠工厂化繁育关键技术研究

近年来,由于捕捞强度逐年增大和生存环境污染等因素,单环刺螠野生资源数量呈连年锐减态势,市场供不应求,价格飙升,单环刺螠养殖潜力和发展空间巨大。本文对单环刺螠不同养殖阶段关键技术进行研究,探索出较为成熟、可行的工厂化繁育新模式,以期为北方开展单环刺螠增养殖和海洋生态修复提供技术支持。

单环刺螠对六价铬暴露响应的转录组学分析

六价铬[hexavalent chromium,Cr(VI)]是海洋中常见的重金属污染元素之一。为探究Cr(VI)对海洋底栖动物的毒性作用,采用高通量测序技术(RNA-seq)对Cr(VI)暴露前后单环刺螠(Urechis unicinctus)体腔细胞进行转录组测序和比较分析。结果表明:Cr(VI)暴露后,筛选到1 352个差异表达基因(DEGs),其中有729个基因表达上调,623个基因表达下调。GO功能注释显示,DEGs主要富集于催化活性、结合、转运体活性、信号转导和抗氧化活性等功能。451个DEGs被注释到172个KEGG信号通路中,主要富集于真核生物核糖体生物合成、醚脂代谢、高级糖基化终末产物-受体信号通路和谷胱甘肽代谢等通路。q PCR结果显示荧光定量结果与转录组测序结果一致,证实了转录组测序结果的可靠性。本研究推测Cr(VI)暴露可激活单环刺螠GSH代谢通路,与通路相关的GSH、GST、PRDX6、RRM1、γ-GT等基因在抵御Cr(VI)暴露过程中发挥重要作用,研究结果可为重金属对海洋底栖动物的毒性机制和水环境监测研究提供参考。

鳗弧菌感染单环刺螠体腔细胞转录组分析

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是水产养殖中常见病原菌之一。为探究鳗弧菌感染海洋经济动物单环刺螠(Urechis unicinctus)后宿主基因表达水平的变化和应答细菌感染的分子机制,运用高通量测序技术对感染鳗弧菌的单环刺螠对照组、易感组和抗感组体腔细胞进行了转录组测序,并对比分析其差异表达基因(DEGs)及信号通路。结果显示,鳗弧菌感染单环刺螠后,易感组体腔细胞差异表达基因数目为2309个,其中1451个基因表达上调,858个基因表达下调;抗感组中DEGs数目为1955个,其中1311个基因表达上调,644个基因表达下调。KEGG通路富集分析显示,与免疫相关的通路主要有MAPK信号通路、过氧化物酶体、内吞作用、溶酶体、氨基酸生物合成等,筛选出的潜在抗感基因主要有牛磺酸分解代谢双加氧酶(Taurine catabolism dioxygenase,TauD)、细胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450)、Casitas B细胞淋巴瘤B(Casitas B lymphoma-b,Cbl-b)、肌动蛋白相关蛋白3(Actin-related protein 3,ACTR3)、热休克蛋白70(Heat shock protein 70,HSP70)、氨基酸通透酶(Amino acid permease,AAPs)、编码葡萄糖激酶(Glucokinase,GCK)、乙醛酸和羟基丙酮酸还原酶(Glyoxylate reductase/hydroxy pyruvate reductase,GRHPR)、胱硫醚β-合酶(Cystathionine beta-synthase,CBS)、组氨酸磷酸酶(Histidine phosphatase,LHPP)、谷草酰乙酸转氨酶2(Glutamic-oxaloacetic transaminase 2,GOT2)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)和细胞分裂周期42(Cell division control protein 42,CDC42),易感基因主要有ADP核糖激化因子(ADP-ribosylation factor,ARF)、细胞粘附素(Cytohesin,CYTH)、EH结构域蛋白1(EH domain-containing protein 1,EHD1)、Ras相关蛋白Rab-8A(Ras-related protein Rab-8A,Rab8A)、钙网蛋白(Calreticulin,CALR)和Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,RAC1)。实验结果可为鳗弧菌对水产养殖动物的感染机制及单环刺螠对病原菌的免疫应答研究提供数据参考。

不同地理环境及养殖模式下单环刺螠氨基酸及脂肪酸营养成分比较

我国、日本和朝鲜沿海地区将单环刺螠作为名贵的海鲜食品,是一种经济价值较高的海产品种,是极有养殖开发前景的海洋动物资源。本文以单环刺螠为研究对象,对大连市、河北省、山东省等地区以及池塘养殖、野生采捕的单环刺螠氨基酸及脂肪酸营养成分比较分析,比较了3种地理环境和2种养殖模式条件下单环刺螠营养成分的特性差异,以期为各地方发展单环刺螠产业提供参考。

单环刺螠生物学及生态学研究进展

单环刺螠(Urechisunicinctus)是中国沿海分布的唯一无管螠目(Xenopneusta)种类,具有较高的营养价值和经济价值。近年来由于过度捕捞,单环刺螠自然资源破坏严重,亟待开展人工养殖以满足人们的需求。本文综述了单环刺螠生物学和生态学方面的研究进展,同时提出了单环刺螠的研究方向,并分析了其养殖前景。

pH、温度和盐度对单环刺螠消化酶和溶菌酶活力的影响

采用L25(56)正交试验法测定了不同pH(6、7、8、9、10)、温度(10、15、20、25、30℃)和盐度(15、20、25、30、35)对体质量为(71.2±8.5)g的单环刺螠肠蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶活力的影响,以及不同盐度对单环刺螠血液溶菌酶活力的影响。试验结果表明,单环刺螠肠消化酶活力的最适环境条件分别为,蛋白酶:pH 8、温度30℃、盐度35;淀粉酶:pH 9、温度25℃、盐度25;纤维素酶:pH6、温度30℃、盐度35;脂肪酶:pH 6、温度25℃、盐度30。盐度15和20两组单环刺螠血液溶菌酶活力均先降后升再降,而盐度30和35两组则先升后降。至处理第4d,各试验组溶菌酶活力依次为:盐度30>25>35>20>15,盐度15和20两组溶菌酶活力显著低于盐度较高试验组(P<0.05)。盐度25~35、pH 6~9为单环刺螠适宜的环境条件,高温(25~30℃)下其消化酶活力较高,而低盐度(15~20)下其消化酶活力和免疫能力明显降低。

单环刺螠消化道的发生和分化

用组织学、组织化学和电镜技术对单环刺(Urechis unicinctus)消化道的发生及分化进行研究。结果表明,单环刺消化道起源于原肠胚期内陷而成的原肠腔;至早期担轮幼虫时期,消化道连通,开始摄食,此时据管腔直径不同消化道可分为口、食道、胃、中肠及后肠。附着变态后,其消化道在结构及功能上都有了明显的发育与分化。至蠕虫状幼虫时期。食道、胃及后肠已出现黏膜下层及肌层。嗉囊与砂囊可明显区分。中肠已产生肌纤维的分化,呼吸肠由中肠分化而来,其胞体细长,且核质比较小,可与中肠明显区分。至幼时期,食道前端产生了咽部的分化,至此消化道各部位在结构及功能上都与成体有了很大的相似性,即由口、咽、食道、嗉囊、砂囊、胃、中肠、呼吸肠、后肠和肛门组成。组织化学研究结果表明,随着发育,消化道各部位分别呈现不同的碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、脂酶、ATP酶、非特异性酯酶及多糖类物质活性。

单环刺螠对硫化物暴露的呼吸代谢适应

研究硫化物暴露后单环刺组织细胞色素氧化酶(CCO)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、延胡索酸还原酶(FRD)等呼吸代谢酶活性的变化,初步探讨了单环刺对硫化物的呼吸代谢适应。将虫体暴露于50,150μmol/L 2个硫化物组和不含硫化物的对照组水体中,分别于暴露后0,2,12,24,48 h和解除暴露后48 h取体壁、呼吸肠等组织进行酶活性分析。结果显示:暴露2 h时,硫化物组CCO活性上升。24 h时,150μmol/L组CCO活性显著低于对照组,到48 h时接近于0,而SDH活性显著低于对照组,FRD活性极显著高于对照组。解除暴露后48 h,虫体的呼吸代谢酶活性与对照组无显著差异。可见,硫化物暴露后,短期内虫体呼吸代谢提高,可能进行硫化物氧化解毒。而随着暴露时间的延长,虫体的呼吸代谢减弱,FRD活性极显著增高,推测体内可能存在将延胡索酸还原成琥珀酸的无氧代谢方式。解除硫化物暴露后,虫体具有较强的自我恢复能力。

单环刺螠虫消化道组织学和细胞学

对单环刺虫(UrechisunicoinctusVonDrasche)消化道的结构进行了组织学和细胞学观察。单环刺虫消化道可分为咽、食道、嗉囊、砂囊、胃、中肠、呼吸肠、直肠和排泄腔。咽、食道和直肠管壁由内向外分为粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜,嗉囊、砂囊、胃、中肠和呼吸肠壁仅由粘膜层和外膜组成。除食道外,胃之前的消化道及直肠上皮细胞均有发达的纤毛,中肠和呼吸肠上皮主要为微绒毛。消化道上皮主要分为3类细胞,第1种为柱状上皮细胞;第2种为粘液细胞;第3种为分泌细胞。粘液细胞和分泌细胞散布于柱状上皮细胞之间,且结构和数量随部位而异:粘液细胞在咽、食道、嗉囊、胃、中肠和直肠上皮中有较多的分布,分泌细胞在砂囊、胃、中肠和呼吸肠中数量较多。

单环刺螠生殖腺的发生及雌体的生殖周期

采用组织学方法观察单环刺螠(Urechis unicinctus)生殖腺的发生、卵巢的结构及其年周期变化。结果显示:3.5cm幼螠中,原始生殖细胞迁至后肠管壁外的结缔组织膜处,并数个集群与该处的体细胞共同构成性腺原基;至4cm幼螠,性腺初具雏形;随着个体的生长和成熟,构成卵巢的细胞不断增殖,于虫体尾部后肠腹侧形成长条形膜状的卵巢,外周为卵原细胞,中央为结缔组织,其两端分别与后肠管壁外侧和体壁内侧相连。根据卵巢的组织学和体腔液中雌性生殖细胞的细胞学特征,单环刺螠的卵巢发育可划分为增殖期、生长期、成熟期、排放期和休止期5个时期。单环刺螠生殖腺为低等的定型类型,其卵巢成熟期较生殖期早半个月。

单环刺螠(Urechis unicinctus)废弃内脏营养成分分析

对烟台市售单环刺螠废弃内脏进行了营养成分分析,结果表明:单环刺螠新鲜废弃内脏蛋白质含量为18.25%,脂肪含量为0.12%,总糖含量为4.09%,灰分为14.30%,Ca为2.10%,Mg为0.41%,Fe为0.32%,Zn为0.03%;对单环刺螠废弃内脏的脂肪酸分析发现,EPA、DHA和DPA均较为丰富,分别占总脂肪酸的21.61%、3.67%和56.24%.单环刺螠废弃内脏具有很好的开发利用价值.

单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅰ的性质和溶栓活性

单环刺螠纤溶酶UFE-Ⅰ的最适反应温度为45℃;最适反应pH为7.0;Mg2+、Mn2+和Fe2+是该纤溶酶的强激活剂;Fe3+、Cu2+、Ag+、Hg+和Pb2+对该纤溶酶具有一定的抑制作用;SBTI和PMSF,完全抑制UFE-Ⅰ,说明该酶为丝氨酸蛋白酶;糜蛋白酶抑制剂部分抑制UFE-Ⅰ,亮抑酶肽、抑蛋白酶肽、苯甲脒较弱的抑制UFE-Ⅰ。与蚓激酶类似,UFE-Ⅰ不仅具有直接的纤溶活力更具有纤溶酶原激活活力(84.0%),另外分别将蚓激酶原料与该酶加入到家兔血栓块中,37℃孵育3 h,结果表明该酶具有比蚓激酶更为强大的溶栓能力。

单环刺螠废弃内脏中粗多糖的提取工艺优化

利用热水浸提的方法进行单环刺蜢（海肠）废弃内脏中多糖的提取。采用单因素试验和L9（3^4）正交试验设计，研究不同pH值、料液比、提取时间和提取温度对单环刺蜢内脏多糖提取率的影响。并采用Fenton体系测定单环刺蜢内脏多糖对羟自由基（·OH）的清除作用。单环刺蜢内脏多糖提取的最佳工艺条件为pHl0、料液比1：40（g／mL）、时间3h、温度60℃。单环刺蜢内脏多糖在质量浓度为50μg／mL时，对羟自由基清除能力可达60％，且具有剂量效应。

硫应激单环刺螠差异表达的初步研究

采用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究了100μmol/L硫化物环境与正常海水中耐硫生物单环刺螠mRNA的表达差异,初步筛选出7条体腔液细胞的差异表达基因,其中1个cDNA克隆片段与其它物种的MAP kinase kinase kinase(MAPKKK)有较高同源性。进一步采用RT-PCR技术对其在硫化物刺激前后的表达进行了检测,结果显示该基因在对照和应激后2 h6、h的个体中表达较弱;刺激12 h后表达量增高,并随应激时间增加,呈明显上调趋势。表明单环刺螠MAPK信号通路可被硫化物刺激激活,进而通过该信号通路调节下游生理反应,为进一步研究单环刺耐硫特性的分子机制奠定了基础。

单环刺螠摄食节律的研究

为研究人工养殖条件下单环刺螠Urechis unicinctus的摄食节律,试验中将粉末状饲料与水按1∶10混合均匀后形成浊液,用分光光度法测定其浊度变化,通过计算每个时段投饵1 h后养殖水体因单环刺螠摄食造成浊度的改变值,来获得各时段单环刺螠的摄食强度。结果表明:单环刺螠不同时段的摄食强度具有极显著性差异(P<0.01);一天中单环刺螠摄食最高峰出现在18:00,次高峰为6:00,且6:00、18:00两个时段的摄食强度显著高于其他时段(P<0.05);摄食最低峰出现在3:00,次低峰为21:00,此2个时段的摄食强度显著低于其他时段(P<0.05),单环刺螠摄食无明显的昼夜节律(P>0.05)。本研究结果可为单环刺螠的投喂策略提供科学参考依据。

单环刺螠(Urechis unicinctus)微卫星标记开发及5个地理种群遗传结构分析

采用高通量测序法从单环刺螠基因组中开发微卫星标记,并通过一个秦皇岛单环刺螠野生群体对其进行多态性评价,利用获得的多态性引物对秦皇岛、烟台、潍坊、青岛、大连5个不同海区的野生单环刺螠群体进行了遗传多样性及遗传结构分析。结果表明:本实验设计的50个微卫星标记能稳定扩增的有38个,其中22个微卫星位点在5个群体中均表现为高多态性,等位基因数(Na)介于24—44之间,多态信息含量(PIC)介于0.921—0.967之间。5个群体总的平均有效等位基因数(N_e)范围为6.629—8.850,平均观测杂合度(Ho)和平均期望杂合度(He)范围分别为0.790—0.912、0.851—0.896,大连群体的杂合度最大(H_e=0.8962),潍坊群体的最小(H_e=0.8510),其中有12个微卫星位点在不同群体中出现显著偏离Hardy-Weinberg平衡的现象。平均遗传分化指数(FST)表明,群体分化水平处于中等分化水平(FST值为0.0880—0.1136);聚类分析显示烟台群体先与青岛群体聚为一支,再与秦皇岛群体聚类,然后跟潍坊群体聚为一支,大连群体单独聚为一支;遗传距离模式(IBD)显示单环刺螠群体的地理距离与遗传距离间不存在显著的线性关系。本研究开发的22对微卫星标记可以用于单环刺螠遗传结构分析研究,为下一步单环刺螠种质资源保护和人工繁育提供参考依据。

单环刺螠体壁肌酶解工艺参数的研究--动物蛋白水解酶

烟台海肠即单环刺螠,为国家地理标志农产品,以其体壁肌为原料进行酶解工艺参数研究。采用动物蛋白水解酶进行酶解,研究发现酶的添加量、pH、酶解时间、酶解温度对氮收率和水解度均具有极显著影响,此酶的适宜添加量为2%,pH为7.0,酶解时间为4h,酶解温度为50℃。在此适宜条件下,单环刺螠体壁肌的氮收率和水解度分别达到94.45%和48.17%,体壁肌中的蛋白质几乎被完全水解到水解液中。