微流控芯片电泳-多重聚合酶链反应法同时测定多个单碱基多态性位点

以微流控芯片电泳为检测平台,建立了多重PCR扩增法同时测定多个单碱基多态性(SNP)位点的方法。先通过PCR扩增得一段含所有待测SNP位点的长片段;用限制性内切酶消化成短片段,再将酶切反应产物与脱氧核糖核酸适配器(DNAadapter)相连;以连接产物为模板,分成两管,分别用n条等位基因特异性引物和一条通用引物进行n重PCR扩增;最后用微流控芯片电泳法分离PCR扩增产物,根据两管扩增产物的芯片电泳图谱中扩增片段的大小判断SNP的类型。以细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因中的5个SNP位点(100C>T、1661G>C、1758G>T、2470T>C和2850C>T)为检测对象,考察了各等位基因特异性引物之间的相互影响和扩增反应的特异性,采用微流控芯片电泳法成功测定了20名健康中国人的CYP2D6基因中5个SNP位点的基因多态性,与聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)测定结果完全一致。

应用聚合酶链反应早期诊断单疱病毒性角膜炎

目的探讨应用聚合酶链反应技术（PCR）早期快速诊断单疱病毒性角膜炎的可行性。方法应用PVR测定各种类型的角膜炎病人97例，其中单疱病毒性角膜炎72例，细菌性角膜溃疡15例，真菌性角膜溃疡10例。分别采集各病人角膜病变处分泌物，按PCR操作常规进行检测。结果收集各种类型的角膜炎病人97例，其中男性59例，女性38例，平均42．6岁。行PCR检测后，阳性65例，阳性率为67．0％，其中单疱病毒性角膜炎72例．阳性65例，阳性率为90．3％。细菌性角膜溃疡15例，真菌性角膜溃疡10例，均未测到阳性结果、结论应用PCR在诊断单疱病毒性角膜炎方面具有敏感性高，特异性强，操作简便快捷，可用于单疱病毒性角膜炎的早期快速诊断。

重叠延伸聚合酶链反应克隆大鼠Foxo3a基因及序列测定

目的获得大鼠Foxo3a基因全长编码区基因。方法运用重叠延伸PCR方法从大鼠脾脏总RNA中扩增Foxo3a编码区基因全长,将其插入pMD19-T载体中进行酶切及测序鉴定。结果Foxo3a编码区基因全长2019bp,与GenBank中大鼠Foxo3a基因同源性为99.9%。结论运用重叠延伸PCR技术可成功克隆高GC含量大鼠Foxo3a的cDNA,为进一步研究该基因奠定了基础。

逆转录-半套式-聚合酶链反应单管法检测血清中HCV RNA

目的 探讨建立一种更简便 ,更特异灵敏的逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)单管法。方法 采用蜡隔将RT和PCR扩增 2个独立的反应体系在 1个Eppendoff(Ep)管中分隔开来 ,设计内外引物 ,优化反应体系及条件 ,使整个检测反应经高温启动继而连续封闭地完成。结果 在 6 0例血透析患者血清中 ,33例 (5 5 % )抗 HCV IgG阳性和 2 7例抗 HCV IgG阴性血清用单管RT PCR分别检出 2 8例 (85 % )和 3例 (9% )HCVRNA阳性 ,并对 3份阳性PCR产物作核酸序列测定。本方法的检测灵敏度为 10 2 拷贝 /ml。结论 RT PCR单管法在保持高灵敏度的前提下 ,提高了特异性 ,具有简单高效 。

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段(英文)

目的:分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法:采用 PANHANDLEPCR,以基因组DNA为模板,通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构,经嵌套式PCR 扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物,PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列,采用限制性 内切酶BamHⅠ消化卡地腐霉基因组DNA,经去磷酸化处理后,在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆 菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA,经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。 结果:获得一大小为876bp的PCR产物,经序列分析验证,该panhandlePCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆 菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论:这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片 段两侧的未知基因片段。

末端标记引物延伸反应对核酸单碱基辨认的实验研究

目的 探讨高保真DNA聚合酶的校正机制在核酸序列单碱基识别中的可能性。方法 采用三末端氚标记的引物与配对及不完全配对的模板进行引物延伸反应 ,对延伸产物片段进行放射性活性的检测。结果 当引物与模板配对时 ,其延伸产物含有可探测标记信号。当引物三末端与模板在单碱基水平不配对时 ,其延伸产物则不含可探测标记信号 ,表明引物三末端带有标记信号的碱基在高保真酶的错配纠正过程中被切除。结论 高保真酶的错配纠正机制与引物的三末端标记结合 ,能够有效辨认核酸序列单碱基 。

聚合酶链反应技术在β－地中海贫血基因诊断中的应用

从云南省德宏州、西双版纳州、玉溪地区和昆明地区采集临床诊断为β－地中海贫血的病例２４例，经提取ＤＮＡ，聚合酶链反应和非同位素（加强化学发光，ＥＣＬ）标记寡核苷酸探针点杂交进行基因诊断。文献报道β－地中海贫血的基因突变主要有十种类型。本组在已完成杂文的病例中最常见的突变为Ｃｏｄｏｎｓ４１－４２，即编码子４１－４２发生框架位移，减少ＴＴＣＴ四个碱基，这与国内广东、四川的研究相似。

聚合酶链反应与临床应用

聚合酶链反应(Polymerse Chain Reaction,PCt)即体外基因扩增技术,是以来自细胞核、线粒体、精子等少量的DNA及RNA分离物作为模板,通过选择性的将特定范围的DNA碱基序列进行体外扩增,而得到一定量的反应产物的一种新技术。一、聚合酶链反应的基本操作方法: PCR法的基本操作步骤有:变性、拼接(退火)、扩增(延伸)。也就是在特定的遗传因子范围的两端(分别在链的5′→3′方向之间)对各一对(两种)低聚核苷酸——引物,4种脱氧核糖苷酸,以及DNA聚合酶的缓冲液中。

88株嗜麦芽窄食单孢菌氨基糖苷类耐药性及其修饰酶基因分析

目的明确2005年8月至2007年7月临床分离的88株嗜麦芽窄食单孢菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性及其修饰酶基因的存在状况。方法用Kirby-Bauer(K-B)药敏试验分析88株嗜麦芽窄食单孢菌对3种常用氨基糖苷类抗生素阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的敏感性,再用聚合酶链反应(PCR)法分别扩增常见的8种氨基糖苷修饰酶基因。结果这88株嗜麦芽窄食单孢菌同时对3种氨基糖苷类抗生素都耐药的有19株,占21.6%(19/88);同时对这3种抗生素都敏感的有12株,占13.6%(12/88);对阿米卡星,庆大霉素和妥布霉素的耐药率分别为22%,69.3%和58%,敏感率分别为70%,22.7%和23.9%。氨基糖苷修饰酶基因aac(3)-Ⅰ和ant(4′)-Ⅱ未检测到;其余6种基因中,aac(3)-Ⅱ,ant(2″)-Ⅰ,aac(6′)-Ⅰ,aac(3)-Ⅲ,aac(3)-Ⅳ和aac(6′)-Ⅱ)的检出率分别是2.3%,5.7%,8%,11.4%,11.4%和12.5%。结论临床分离的嗜麦芽窄食单孢菌对氨基糖苷类修饰酶携带率不是很高,但氨基糖苷类抗生素耐药情况却很严重。

精神分裂症患者中单胺氧化酶A和B多态性位点的连锁不平衡研究

目的 为研究单胺氧化酶与精神分裂症的关系。方法 采用聚合酶链式反应 ,对 140例无血缘关系的高加索男性精神分裂症患者和 91例对照者的两个X连锁的微卫星序列即单胺氧化酶A位点中的 (AC)n重复序列和单胺氧化酶B位点的 (TG)n等位基因进行了研究。结果 基因分布频率在病人组和对照组中未发现差异。但 (AC) 18(TG) 2 3 单倍体增多与精神分裂症有关 ,相对危险度是 4 0 5 (95 %CI 1 15～ 14 2 6) ,精确概率P =0 0 11,连锁不平衡系数在精神分裂症组是 0 0 19;在对照组是 - 0 0 46。

肌肉糖原合酶基因碱基序列的探讨

目的:探讨中国天津地区人群中肌肉糖原合酶基因(GYS1)的XbaI多态性。方法:采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)方法对334例2型糖尿病患者(T2DM组)和116例正常对照者(对照组)的GYS1进行XbaI多态性检测,选择A1/A1基因型和A1/A2基因型PCR样品各1例进行测序。结果:在T2DM组中未检出XbaI多态性A2等位基因。在对照组中发现1例A1/A2基因型,没有发现A2/A2基因型,A2等位基因频率为0.0043,A1/A2基因型频率为0.0086。2组之间A2等位基因的频率差别无统计学意义。测序的2例PCR样品碱基序列均有3处与美国国立医学图书馆网站上GenBank公布的人类GYS1内含子14碱基序列有差异。结论:中国天津地区人群中GYS1的XbaI多态性与T2DM无关。测序发现的3处差异很可能与种族不同、基因变异或PCR方法本身的误差有关。

应用引物延伸预扩增反应技术检测孕妇血浆中的胎儿DNA

目的 :建立一种检测孕妇血浆中胎儿DNA的新方法。方法 :对 6 5例 5～ 41孕周的孕妇血浆中胎儿DNA采用引物延伸预扩增 (PEP)后行特异性位点聚合酶链反应 (PCR)扩增 ,并用探针微孔板杂交法检测PCR产物。扩增的基因为Y染色体短臂SRY基因 ,扩增片段的大小分别为 35 1bp和 2 5 4bp。 结果 :46例妊娠男性胎儿的孕妇中 41例血浆中出现SRY基因扩增带 ,检出率 89.13 % ;19例妊娠女性胎儿的孕妇中 3例 (15 .79% )为假阳性。本研究孕早、中、晚期的性别符合率分别为 10 0 %、90 .91%、75 % ,总符合率 86 .15 %。结论 :利用PEP法能解决孕妇外周血中胎儿细胞数量太少达不到常规扩增条件所要求的最低模板量的问题 ,同时配合探针微孔板杂交法能使诊断结果更准确。

BCPT对小鼠单胺氧化酶活性和慢性应激抑郁大鼠的影响

目的：研究一种拟青霉代谢物提取物（BCPT）对小鼠单胺氧化酶（MAO）活性和慢性不可预见性应激（CUS）大鼠的影响方法用紫外分光光度计测定小鼠脑、肝组织MAO的活性。采用CUS法，造成大鼠抑郁模型。采用开野法和糖水消耗量法观测大鼠行为；用高效液相-电化学法检测其海马区5-HT、DA、NE及其代谢产物5-HIAA、DOPAC的含量；采用逆转录-聚合酶链反应法检测其皮质和海马区MR、GRmRNA表达；用紫外分光光度计测定其血清MDA、NO、SOD、GSH—PX、CAT含量。

移动单孢菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达

目的克隆与表达移动单孢菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因。方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从移动单孢的基因组DNA中扩增出PDCzm基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。结果扩增出DNA碱基对数目约1.7 kb的PDCzm基因,成功构建其表达质粒pZM 22 b,对转化菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的37.9%。结论成功构建高效表达PDCzm基因的工程菌株,为实现利用PDCzm进行的生物转化奠定了基础。

一步PCR法在单碱基定点诱变中的应用

定点诱变技术广泛应用于基因工程和蛋白质工程，常用的方法有化学诱变、寡核苷酸介导的诱变，盒式诱变和基于PCR的诱变，其中基于PCR的诱变包括重叠延伸PCR（over—lapextensionPCR，OE—PCR），大引物PCR（megaprimerPCR），环状质粒PCR。本方法属于环状质粒PCR，与常用的OE—PCR相比，本方法在质粒上进行诱变更为简便快捷，只需设计一对引物。进行一次PCR。

多伞阿魏简单重复序列区间-聚合酶链反应体系的建立和优化

目的:建立并优化多伞阿魏简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链反应(PCR)体系。方法:通过单因素试验确定影响多伞阿魏ISSR-PCR扩增结果的Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、DNA模板最佳水平范围。对Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA进行5因素4水平的正交试验,优选最佳ISSR-PCR体系条件。ISSR-PCR扩增结果用SPSS 18.0统计软件分析。结果:不同水平的因素对PCR均有明显影响,其中Mg2+、dNTPs、引物影响最大。多伞阿魏ISSR-PCR最佳反应体系为:在50μl的反应体系中含有10×Taq Buffer 5μl、Mg2+2.0 mmol/L、dNTPs 0.4 mmol/L、引物0.4μmol/L、Taq DNA聚合酶1.75 u/50μl、DNA模板0.25 ng/μl。在此基础上,从100条引物中筛选出15条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的多伞阿魏ISSR-PCR体系具有较高的稳定性和重现性,可为进一步利用ISSR技术进行多伞阿魏遗传多样性分析、不同种源鉴定及亲缘关系分析提供基础。

引物末端不同碱基对聚合酶链反应产物影响

目的探索引物末端3′端不同碱基对聚合酶链反应产物的影响。方法以含有乙肝病毒(HBV)完整基因组的重组质粒pUC-19为模板,利用3′端碱基分别为A,T,C,G的下游引物,在相同的上游引物和退火温度下进行聚合酶链反应。结果不同的反应体系在相同退火温度下目的产物和引物二聚体形成不同;A表示上游引物,P表示下游引物;下游引物共计4条,分别用P1、P2、P3、P4表示,其3′端碱基分别为T,G,A,C。上下游引物共4对,分别用AP1、AP2、AP3、AP4表示;退火温度为50℃时,AP1和AP4有明显的扩增产物,AP3扩增产物稍少,AP2产物肉眼观察不到,有非特异性产物生成;退火温度升至55℃时,AP1和AP2有明显的扩增产物,AP4少量扩增产物,P3产物肉眼观察不到,AP1和AP4反应体系引物二聚体生成情况基本相同,AP2和AP3引物二聚体生成较少;退火温度升至62℃时,AP1和AP2有明显的扩增产物,AP4扩增产物稍少,AP3产物肉眼观察不到,可观察到引物二聚体生成稍多。结论3′端不同碱基对聚合酶链反应产物有很大影响。

基于荧光定量PCR扩增反应的SNP测定法

建立一种利用荧光定量PCR扩增反应进行单核苷酸多态性(SNP)快速测定的方法.以人β肾上腺素受体2基因中的Arg16Gly为研究对象,利用荧光染料SYBRGreenⅠ标记定量PCR产物,通过PCR生长曲线和融解曲线分析结果进行SNP分型.为提高SNP测定的特异性,分别在野生型和突变型等位基因的特异性引物3′端倒数第3个碱基位置,引入了一个人为错配碱基,使引物的错误延伸率显著降低,大大提高了SNP分析的准确性.通过DNA测序验证荧光定量PCR对β肾上腺素受体2基因中Arg16Gly分型结果的准确率.实验结果表明,所建立的方法操作简便,结果准确,适合进行大规模样品的SNP检测工作.

异源双链泳动分析法对流行性角膜结膜炎致病腺病毒分型的研究

背景 目前对流行性角膜结膜炎致病腺病毒的分型多采用直接DNA测序法,而异源双链泳动分析（HMA）法可对腺病毒进行基因分型,且更符合成本-效益原则,HMA法对流行性角膜结膜炎致病腺病毒分型的应用尚少有研究.目的 将流行性角膜结膜炎致病腺病毒六邻体蛋白编码区内保守区的测序结果与HMA的结果进行对照,评价HMA法在流行性角膜结膜炎病原体检查中的有效性和可行性.方法 在知情同意的情况下收集2010年1月至2012年12月在上海市眼病防治中心和上海市急性出血性结膜炎防控办公室下属红眼病监测站点就诊的可疑流行性角膜结膜炎患者214例,取患者结膜囊的结膜拭子标本214份.使用QIA-amp minikit提取结膜拭子标本中的病毒DNA,然后通过PCR法扩增病毒DNA六邻体蛋白编码区内366 bp的保守序列,并对该片段进行基因测序,确定是否为腺病毒及其分型.采用HMA法同时对PCR扩增产物进行分析,将HMA结果与基因测序法进行比较.结果 使用QIA-amp minikit提取的病毒基因组DNA经质量分数1％琼脂糖凝胶电泳可见边界清楚的长约35 kb的金黄色荧光条带,无拖尾现象,DNA吸光度比值（A260/A280）约为1.7.214例患者中,经PCR检测确定为腺病毒感染者109例,经基因测序确定为腺病毒l型（AdVl）者4例,AdV2者33例,AdV3者15例,AdV4者12例,AdV8者19例,AdV19者15例,AdV37者8例.HMA法可以鉴别AdV1、AdV2、AdV3、AdV8、AdV19和AdV37,其结果与基因测序结果一致.AdV4的DNA突变点为59.6％,超过10％,不适合HMA法.结论 针对六邻体蛋白编码区内保守区域的基因测序是腺病毒分型的重要方法之一,可以快速确定流行性角膜结膜炎是否系腺病毒感染引起,并可以确定腺病毒分型.HMA的结果与基因测序相一致,可作为大规模分子流行病学调查的检测工具.

持续气道正压对高龄肺癌患者单肺通气中肺泡灌洗细胞IL-1β和IL-8 mRNA表达的影响

目的观察持续气道正压(continuous positive airway pressure,CPAP)对高龄肺癌患者单肺通气(one-lung ventilation,OLV)中非通气侧肺泡灌洗细胞IL-1β和IL-8mRNA的表达,在分子水平上探讨CPAP对肺炎性反应的影响。方法选择单肺通气下年龄>65岁的肺癌开胸手术患者28例,ASAⅠ～Ⅱ级,随机分为对照组(n=14)和CPAP组(n=14)。对照组在麻醉期间非通气侧肺的支气管导管直接开口于大气中,CPAP组麻醉期间非通气侧肺持续给予CPAP(压力3～5cmH2O,1cmH2O=1.02Pa)。在单肺通气开始和通气2h后分别对两组患者非通气侧肺用纤维支气管镜行支气管肺泡灌洗(bronchoalveolar lavage,BAL),从灌洗液中收获细胞提取RNA,逆转录合成cDNA,以-βactin为内标准作PCR后电泳扫描求积,检测肺泡灌洗细胞IL-1β和IL-8mRNA的表达。结果单肺通气2h后,对照组比CPAP组非通气侧肺肺泡灌洗液中IL-8和IL-1βmRNA的表达显著增加(P<0.01)。结论单肺通气中非通气侧肺给予适度的CPAP可以有效减少高龄肺癌患者肺泡灌洗细胞促炎性细胞因子mRNA的表达水平,抑制肺局部炎症反应,对非通气侧肺可能有一定的保护作用。