单碱基编辑技术在单基因遗传病治疗中的研究进展

在目前已知的人类致病遗传变异中,点突变约占58%。近年来在成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)/Cas系统上发展而来的单碱基编辑技术实现了碱基之间的转换或颠换。虽然到目前为止碱基编辑器还存在局限性,然而它为点突变导致的单基因遗传病的治疗带来了新曙光。本文主要阐述近年来单碱基编辑技术的前沿进展及其在单基因遗传病治疗中的研究进展,以期为相关领域的研究及其在未来的临床应用提供参考。

基因编辑之“新宠”—单碱基基因组编辑系统

近年发展起来的人工核酸酶可通过引起特定位点的DNA双链断裂实现对目的片段的有效编辑。为进一步提高碱基修改的效率和精确度,2016年研究者们利用CRISPR/Cas9识别特定DNA序列的功能,结合胞嘧啶脱氨酶的生化活性发明了将胞嘧啶高效转换为胸腺嘧啶(C>T)的嘧啶单碱基编辑系统(base editor)。这一系统虽然能精准实现嘧啶直接转换,大大提高精确基因编辑效率,但美中不足的是无法对嘌呤进行修改。近期,Nature报道了将细菌中的t RNA腺嘌呤脱氨酶定向进化形成具有催化DNA腺嘌呤底物的脱氨酶,将其与Cas9系统融合发明了具有高效催化腺嘌呤转换为鸟嘌呤的新工具—腺嘌呤单碱基编辑系统(ABEs,adenine base editors)。本文总结了单碱基编辑工具的发展历程和最新研究进展,着重介绍ABEs的研发过程,并对单碱基编辑工具今后的应用方向和研发方向进行展望。

基于CRISPR系统的基因编辑技术的研究进展

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统,即成簇的、间隔规律的短回文重复序列。该系统广泛存在于40%的细菌及90%的古细菌中,主要用于应对外源DNA或者病毒入侵的免疫防御[1]。根据该特性,Jinek等[2]将tracrRNA及crRNA整合形成单链引导RNA(small guide RNA,sgRNA),该sgRNA由5′端负责与靶序列互补配对的20个核苷酸及3′端参与Cas9蛋白识别的发卡结构组成,首次在体外实现对靶标序列的切割,为CRISPR/Cas基因编辑技术的广泛应用奠定了重要基础。

基于三联体和金门克隆的快速TALE模块组装技术

目的:通过降低转录激活因子样效应物(Transcription Activator-Like Effector,TALE)重复,建立新型简单快速的组装方法。方法:利用密码子的简并性,建立含64种组合的三联体非重复序列库。设计一系列PCR引物,其5’端带有Ⅱ型限制性内切酶识别序列。通过PCR扩增TALE三联体,Esp3I酶切获得DNA突出末端按顺序互补配对。所有三联体片段与TALE骨架载体混合后,用金门(Golden Gate)克隆技术进行有序组装,构建获得具有特定DNA靶向能力的TALE表达载体。结果:利用三联体,可通过一步反应实现简单快速TALE的构建,正确组装的效率高。将TALE与脱氨酶融合,再与CRISPR/Cas9系统组合成Ta C9-BE系统,在293T细胞中5个位点实现了高效的单碱基编辑。结论:结合TALE三联体库和金门克隆技术建立了一种新的TALE构建技术——Tri-GG,这种方法具有易操作、成本低、时间短的优势,为TALE在基因编辑的应用提供了一个新的技术途径。