一种新颖的棉铃虫单粒包埋核多角体病毒表达系统

将含有低拷贝数的mini Freplicon、一个卡那霉素抗性基因和一个lacZα基因 8.6kb的DNA片段经同源重组置换到棉铃虫核型多角体病毒基因组中的多角体蛋白基因内 ,构建了既能在E .coli内复制又可在昆虫细胞内复制形成完整的病毒粒子棉铃虫核型多角体病毒Bacmid(HaBacmid HZ8)。另外将HaSNPV的多角体蛋白基因和P10启动子序列取代 pFastBacDual质粒上的AcMNPV的多角体启动子序列和P10启动子序列 ,构建插入HaSNPV多角体蛋白基因和P10启动子序列的HapFastBacPhP10供体质粒。利用HapFastBacPhP10供体质粒将eGFP基因转位至HZ8的Tn7附着位点上 ,随后将含有eGFP基因的重组HaBacmidDNA转染至HZAm1细胞内。转染 5d后 ,细胞核内能形成典型的多角体 ,在萤光显微镜下观察到细胞内显示出强烈的绿色萤光。

中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒(HaSNPV)HindⅢ-Ⅰ片段的序列分析与基因排列研究

对中国棉铃虫单粒包埋核多角体病毒 (HaSNPV)基因组中的HindⅢ Ⅰ片段的序列进行分析 ,该片段全长75 0 1nt,包括 10个开放阅读框 :AcMNPVORF111的同源基因 (Ac111) ,晚期表达因子 2 (lef 2 )基因 ,病毒核壳结构蛋白 p2 4基因、gp16 基因、多角体包膜蛋白 (polyhedronenvelopeprotein ,pep)基因、AcMNPVORF6 3的同源基因(Ac6 3) ,38 7kD基因 ,晚期表达因子 1(lef 1) 基因 ,及两个特有基因HaSNPV orf5 91和HaSNPV orf435。基因组的排列比较分析发现与AcMNPV有较大区别。

中国棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒多角体蛋白基因的序列分析

以AcMNPV的多角体蛋白基因为探针，定位了中国棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HaSNPV）的多用体蛋白基因。序列测定表明，HaSNPV的多角体蛋白基因编码区为738个核苷酸，编码246个氨基酸，预计蛋白质分子量为29kDa。同源性分析表明，HaSNPV与美洲棉铃虫单粒包理核型多角体病毒（HzSNPV）具有最高的同源性，在整个阅读框架中只有4个碱基的差异，其中第179位碱基的变化导致唯一的氨基酸变化，这种变化并未导致其二级结构的改变。此外，两种病毒该基因的启动子结构也完全一样。HaSNPV与其它的SNPV和MNPV的同源性明显要低。结果预示HaSNPV与HzSNPV可能为同种病毒的不同变种。

棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV)复制的研究——Ⅰ.细胞病理学和病毒复制的一些特性

本文报道了棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒(Heliothis armigera single nucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, HaSNPV)在棉铃虫及棉铃虫蛹卵巢细胞系SFE-HA-8212中的复制。HaSNPV的复制和其他的核型多角体病毒大体相符,复制过程也可分为形成出芽型病毒与形成包埋型病毒这两个时相。研究了影响病毒在细胞中复制的诸因素,包括病毒感染复数、细胞接种密度和细胞生长阶段等。在适宜的条件下平均每细胞可生产出芽型病毒14PFU,多角体24个。生成的病毒具有感染力。这些表明SFE-HA-8212细胞可供HaSNPV有效复制。同时,作为细胞群体该细胞系对HaSNPV感染的反应并非均一,其中有89.65±21.4％的感染细胞释放病毒,但仅有37.85±6.7％的细胞形成多角体。表明HaSNPV的感染并不一定导致形成多角体,在大部分感染细胞中病毒复制进行到产生病毒粒子就停止了。初步讨论了这种不均一性的原因。

中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒gp^(37)基因的序列分析

昆虫杆状病毒的 gp37基因与昆虫痘病毒纺锤体蛋白 (fusolin)基因具有较高的同源性。本研究通过末端测序法和引物步移法双向测定了中国棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒 (HaSNPV)gp37基因的核苷酸全序列。HaSNPV的 gp37基因开放阅读框为 84 0个核苷酸 ,共编码 2 79个氨基酸 ,预计蛋白质分子量为 31kDa。在 gp37基因起始密码子上游有一典型的杆状病毒晚期转录启动子结构GTAAG和两个TATAboxes。HaSNPVGP37前 18个氨基酸有很强的疏水性 ,可能是分泌信号肽序列。 16种GP37/Fusolin的氨基酸序列同源性比较分析表明 ,HaSNPVGP37与其它gp37基因的同源性较高 ( 4 0 60 % ) ,与痘病毒的Fusolin的同源性达 30 % 4 0 %左右。这些蛋白有 5个高度保守区 ,预计这 5个保守区为GP37/Fusolin的功能区。

棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒在细胞系中持续感染的建立和特性

棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒 (Helicoverpaarmigerasinglenucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)能够在棉铃虫蛹卵巢细胞素SFE -HA - 82 12中有效复制 ,引起细胞解体死亡。通过培养HaSNPV感染后残存的细胞 ,建立了一株持续感染的细胞。该细胞在传代培养的 6个月时间内 (约 2 5次传代 ) ,持续地释放有感染力的病毒粒子 ,培养液中病毒的效价多在 10 4 TCID50 /ml上下 ,同时有一小部分细胞 (1%左右 )中形成多角体 ,释放病毒的细胞占总细胞数的 1 0 %～ 3 8%。持续感染细胞的生长特性与原细胞系相比有一定的变化 ,对HaSNPV感染的敏感性有所降低。另一方面 ,持续感染细胞所释放的病毒对SFE -HA - 82 12及棉铃虫幼虫的感染力也有所降低。讨论了持续感染的可能机制。

一株草地贪夜蛾核型多角体病毒新分离物的室内毒力测定与基因组分析

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是我国重要的入侵农业害虫。草地贪夜蛾核型多角体病毒是专一性感染草地贪夜蛾的病原。本研究于江西省南昌市玉米田分离得到一株多粒包埋型草地贪夜蛾核型多角体病毒分离物,命名为草地贪夜蛾核型多角体病毒江西分离物(SfMNPV_JX),其对本地草地贪夜蛾幼虫毒力高,LC 50达到1.634×105 PIB/mL。全基因组测序表明,SfMNPV_JX基因组全长134241 bp,共包含140个ORF,系统发育分析显示,SfMNPV_JX属于α-杆状病毒GroupⅡ,是SfMNPV的一个分离物,与草地贪夜蛾核型多角体病毒哥伦比亚分离物(SfMNPV_Colombian)最为近似,序列相似性为97.85%。上述研究结果为研发绿色高效的草地贪夜蛾生物杀虫剂提供重要依据。

甜菜夜蛾核型多角体病毒颗粒剂制备及其抗逆性能评价

甜菜夜蛾核型多角体病毒(SeNPV)具有专一性和高效性,可以有效控制甜菜夜蛾种群,而且对环境和生态安全。为了提高甜菜夜蛾核型多角体病毒的稳定性,以海藻酸钠为包埋材料,通过优化载体用量和进料速率等条件,采用喷雾法制备了病毒颗粒剂,并对其相关性能进行了表征和评价。结果表明:海藻酸钠质量浓度为1%,进料速率为13mL/min时制备的病毒颗粒剂呈不规则形状,颗粒剂产率79.4%,病毒含量1.0×10^(6)PIB/g,D_(50)在130μm左右。经颗粒剂海藻酸钠包埋的甜菜夜蛾核型多角体病毒具有良好的热稳定性和抗紫外性能,同时不会影响其对甜菜夜蛾幼虫的致病力。

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒几丁质酶基因的研究

中国棉铃虫多粒包埋型核多角体病毒VHA273毒株的几丁质酶基因的开放阅读框大小为1713bp,编码570个氨基酸残基,分子量约60kDa.氨基酸序列分析显示,杆状病毒与原核生物特别是细菌的几丁质酶具高度同源性,暗示杆状病毒的几丁质酶基因与细菌的几丁质酶基因有更为接近的进化关系,可能源于共同的祖先.

草地贪夜蛾核型多角体病毒Hub1的稳定性及对草地贪夜蛾的田间防治效果

草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda是一种破坏性极强的害虫,严重威胁粮食安全。草地贪夜蛾核型多角体病毒Hub1 (S. frugiperda nuclear polyhedrosis virus Hub1,SpfrNPV Hub1)是首个专一性针对草地贪夜蛾的病毒杀虫剂,具有较好的应用前景。本研究采用药膜法评价不同温度、pH值、光照条件等处理对SpfrNPV Hub1活性及稳定性的影响,并开展了20亿病毒包涵体(polyhedral inclusion body,PIB)/mL SpfrNPV Hub1悬浮剂防治草地贪夜蛾田间药效试验。稳定性测定结果表明:SpfrNPV Hub1在pH 4和pH 7,4℃及25℃条件下稳定,在pH9条件下较不稳定,在54℃高温及4000 lx强光照射条件下不稳定。田间药效试验结果显示:20亿PIB/mL SpfrNPV Hub1悬浮剂对草地贪夜蛾有较好的防治效果,制剂用量为1500~1875mL/hm^(2)时,药后7 d和14 d的防效分别达81.18%~82.57%和81.23%~83.06%,持效期长。本研究明确了不同温度、pH值、光照条件对SpfrNPV Hub1活性及稳定性的影响,为指导应用SpfrNPV Hub1防治草地贪夜蛾提供了重要技术支撑。

落叶松尺蛾核型多角体病毒形态特征及分子检测技术建立

【目的】落叶松尺蛾核型多角体病毒(Erannis ankeraria nucleopolyhedrovirus,EranNPV)是有效调控落叶松尺蛾种群数量和质量的重要生物因子,明确EranNPV超微形态学结构,研究并建立其精准灵敏的分子(PCR)快速检测技术,有助于深入探究该病毒的传播机制和林间流行规律,从而为利用该病毒持续控制落叶松尺蛾提供技术支撑。【方法】利用扫描电镜和透射电镜对EranNPV多角体的外部形态和内部结构特征进行观察;根据EranNPV的ac54基因设计用于PCR检测的特异性引物EaV,通过多种昆虫病毒的PCR扩增结果验证引物特异性,测试该PCR检测技术体系对EranNPV基因组DNA和病毒悬浮液的灵敏性。【结果】电镜观察结果表明,该病毒多角体多为表面光滑的不规则多面体,少数多角体表面散布孔洞凹陷,平均直径为1.43±0.20μm,多角体内的病毒粒子呈单束分布,平均长度为219.14±17.50 nm;以EaV为引物,只有EranNPV能够扩增到目的条带,利用EaV为引物建立的PCR检测技术对EranNPV基因组DNA的检测灵敏度可达10 fg/mL,对EranNPV悬浮液的检测灵敏度可达1×102 OBs/mL。【结论】EranNPV为典型的单粒包埋型核型多角体病毒,利用EaV引物建立的PCR检测技术具有高度的特异性和灵敏度,有望进一步应用于EranNPV的林间传播和流行病学研究当中。

家蚕核型多角体病毒Bm11基因对病毒基因转录及ODV病毒粒子包埋的影响

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bm11是一个高度保守的基因,但其在病毒感染过程的作用尚不清楚。利用λ-Red同源重组技术构建Bm11敲除型病毒,并利用Bac-to-Bac系统重新构建恢复型及野生型重组病毒。转染试验及荧光定量PCR(qPCR)结果表明,Bm11基因缺失并不影响出芽型病毒粒子(BV)的产生及病毒基因组DNA复制,但对晚期和极晚期基因的转录水平影响显著(P<0.01)。经皮注射虫体实验结果显示,敲除型病毒的致死中时(LT50)明显长于恢复型病毒和野生型重组病毒。经口感染实验表明,添食106个野生型重组病毒或恢复型病毒多角体(OB)的家蚕死亡率均达到100%,而添食敲除型病毒多角体的家蚕死亡率只有64.89%,且死亡时间明显延长。透射电子显微镜观察发现,与恢复型病毒和野生型重组病毒相比,Bm11敲除型病毒感染细胞内多角体包埋的包涵体衍生型病毒粒子(ODV)数量显著减少(P<0.01)。综上所述,Bm11虽不是BmNPV复制必需基因,但该基因的缺失对病毒晚期和极晚期基因转录以及ODV粒子包埋效率均有重要影响。

日本三株斜纹夜蛾核型多角体病毒的增殖特性及其多角体蛋白基因的序列分析

利用斜纹夜蛾Spodopteralitura培养细胞 ,对近年来在日本本州、九州和四国等地发现并筛选出的对斜纹夜蛾幼虫具有强烈杀虫活性的 3株斜纹夜蛾核型多角体病毒 (SpltMNPV) (K 3、G1 2和G10 3)进行了生物学活性和分子生物学的初步研究 ,克隆了多角体蛋白基因 ,并进行了序列分析和比较。结果表明 :(1)SpltMNPV日本分离株K 3、G1 2和G10 3分别具有不同的特征性酶切图谱 ,分别属于 3种基因型 (A型、B型和C型 ) ;(2 ) 3个分离株的芽生型病毒 (buddedvirus)产生能力和多角体产生能力有差异 ,免疫印迹分析表明 ,多角体蛋白的分子量也不同 ;(3)日本株SpltMNPV核型多角体蛋白结构基因由 74 7个核苷酸编码序列 (编码 2 4 9个氨基酸 )组成 ,其序列与中国株SpltMNPV的同源性为 98 9% ,与其他 6种核型多角体病毒有较高的同源性 (6 1 7%～ 74 2 % ) ,但其 5′端侧翼序列 (nt_1～_10 0 )与AcMNPV和BmNPV相比差异显著 ,在对该基因表达调控起决定性作用的 8个高度保守核苷酸序列中 (nt_4 4～_5 1)有 2处发生自然突变。

耐家蚕核型多角体病毒病蚕品种“华康2号”的育成

以对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)侵染具有较强耐受力,且综合经济性状优良为家蚕新品种选育目标,选择我国蚕区推广量较大的家蚕品种秋丰和白玉作为受体,用BmNPV耐受性基因载体品种N作供体,采用杂交技术将耐病基因导入受体品种,再用受体品种秋丰和白玉分别作回交亲本连续进行4次回交,纯合固定耐病基因,通过系统选育提高、稳定回交后代的综合经济性状,育成对家蚕核型多角体病毒病具有较强耐受性的新品种秋丰N×白玉N(定名为华康2号)。BmNPV对新品种的LC50为2.033×109个/mL,是原系统秋丰×白玉LC50值的12 115倍,新品种的耐病力显著增强。新品种的发育经过及丝质、茧质等主要经济性状与原系统相仿,万头收茧量、万头产丝量分别提高5.5%和9.6%,解舒丝长增加60 m,洁净提高1.1分,达到实用化的水平。

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析

棉铃虫核型多角体病毒多角体蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析王根张传溪贡成良金伟吴祥甫（中国科学院上海生物化学研究所，上海２０００３１）关键词棉铃虫，核型多角体病毒，多角体蛋白基因，核苷酸序列，同源性棉铃虫Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉ...

美国白蛾核型多角体病毒传播途径及对寄主的持续作用

用不同浓度的美国白蛾核型多角体病毒亚致死剂量感染美国白蛾4龄和5龄幼虫,并分别收集不同处理的残余带毒试虫进行室内传代饲养。结果表明:病毒对寄主昆虫不仅具有直接致死作用,而且对蛹重和雌虫产卵量均有明显影响,尤其是对亲代、子一代和子二代寄主昆虫。对病毒传播途径的研究证实HcNPV可通过多种途径传播到寄主种群中。

柞蚕核型多角体病毒研究进展

柞蚕核型多角体病毒(AntheraeapernyiNuclearPolyhedrosisVirus,简称ApNPV) ,属杆状病毒科包含体杆状病毒亚科核型多角体病毒属 ,是柞蚕核型多角体病的病原。该成熟病毒包含体的断面分三层结构 :最外层是致密层 ,次外层是多角体蛋白层 ,内部是病毒束。柞蚕核型多角体病毒的核酸为DNA ,经限制性内切酶PstⅠ,HindⅢ,BamHⅠ,XhoⅠ,SalⅠ,EcoRⅠ和EcoRⅠ +BamHⅠ酶解后 ,电泳分别形成31,25,6,15,24,5,7条谱带。柞蚕核型多角体病毒主要通过食下和体壁创伤途径感染柞蚕幼虫 ,不同病毒株对柞蚕的致病性存在着差异。柞蚕幼虫消化液对柞蚕核型多角体病毒有溶解、灭活作用 ;柞蚕幼虫中肠围食膜对柞蚕核型多角体病毒有灭活作用。柞蚕核型多角体病毒多角体在自然条件下有自然裂解现象 ,游离的病毒粒子在自然条件下很快失活。目前已建立柞蚕核型多角体病毒载体表达系统 ,并在分别在体内。

dsRNA对家蚕核型多角体病毒复制增殖的抑制效果

以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)复制必需的极早期基因ie-1和细胞释放型病毒CRV入侵关键基因gp64为靶序列,分别人工设计并体外转录出dsRNA I1(438 bp)和dsRNA G1(337 bp),用家蚕培养细胞BmN研究目标dsRNA对BmNPV复制、增殖的抑制效果。结果表明:dsRNA I1能有效地抑制BmNPV在BmN细胞中的增殖,最大抑制效果使培养液中的病毒滴度(TC ID50)比对照降低了104.30倍;dsRNA G1能显著地抑制新形成的病毒粒子的细胞侵染能力,最高可使培养液中的病毒滴度降低103.17倍。

茶毛虫核型多角体病毒对茶毛虫的致病性研究

研究了茶毛虫核型多角体病毒（Euproctis pseudoconspersa nuclear polyhedrosis virus，简称EpNPV）的室内外增殖、分离粗提，以及对茶毛虫（Euproctis pseudoconspersa Strand）室内毒力测定、田间防治效果和病毒电镜检测。采用室内离体茶树嫩枝水培，10^6 PIB／ml EpNPV喷雾接种2～3龄茶毛虫，或大田直接喷雾处理2-3龄茶毛虫，在罹病幼虫液化前及时收集虫尸，完成病毒增殖。10^6 PIB／ml、10^7 PIB／ml、10^8 PIB／ml EpNPV室内处理第12天致病率分别为43．60％、76．13％和64．68％；第14天致病率分别为59．17％、95．71％和95．70％。大田试验10^7 PIB／ml喷雾处理第15天防治效果达78．11％。经透射电镜观察田间防治大量感病茶毛虫虫尸，证实为EpNPV致病死亡。

gp64基因相应dsRNA对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)增殖的抑制

【目的】研究gp64基因相对应的多个dsRNA对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制效果。【方法】体外合成dsRNA,通过病毒滴度试验、实时定量RT-PCR法研究gp64基因的不同区域、不同长度与RNAi干扰效果的关系。【结果】供试的6个dsRNA的最大抑制效果相当(滴度TCID50的最大抑制差值为4.00左右);经RNAi的不同时间点的gp64mRNA表达水平均明显下调(P<0.01),其中48h的gp64mRNA的表达量约为对照的1/300。【结论】6个dsRNA均能有效地抑制病毒的基因表达和增殖;gp64ORF第1390～1499位点(G3-3)是RNAi的较佳靶位点。