366例患者单纯疱疹Ⅱ型病毒感染的分析

目的:了解单纯疱疹Ⅱ型病毒(HSV2)感染与性传播疾病(性病)、流产、死(畸)胎和不孕不育等疾病的关系。方法:应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HSV2-IgMI、gG抗体,对366例患者和80例健康对照者HSV2感染状态进行调查分析。结果:HSV2-IgMI、gG抗体阳性率患者组:13.1%、49.2%(48/366、180/366);对照组2.5%、25.0%(2/80、20/80),两组阳性率比较,差异非常显著(χ2=7.431,15.519;P<0.01,P<0.01)。结论:HSV2感染与性病、流产、死(畸)胎和不孕不育等疾病的部分患者的发病有关。

敲减单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)UL30蛋白表达可抑制HSV-2复制

按照shRNA(small hairpin RNA)设计要求,选择编码单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA多聚酶催化亚单位的UL30(unique long 30,UL30)基因序列保守区域,设计、合成并构建表达UL30序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pUL30.通过磷酸钙转染法将其转染入HEK(human embryonic kidney)293细胞中,用蛋白印迹法检测对HSV-2 UL30蛋白表达的影响,观察受染细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),终点滴定法测定细胞上清液中病毒感染滴度(50%tissue culture infective dose,TCID50).结果表明,针对UL30基因的siRNA能有效抑制UL30蛋白表达,同时显著抑制受染细胞的CPE,降低上清液中病毒感染滴度.提示本研究建立的针对UL30基因特异性siRNA能有效阻断HSV-2在HEK293细胞内的复制,UL30基因是一个潜在的抗HSV-2复制的药物靶标.

大青叶提取物抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的体外实验研究

目的检测大青叶提取物体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-Ⅱ)的作用。方法以Vero细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,通过观察细胞病变效应(CPE)和改良MTT比色法来测定药物的细胞毒性、药物对HSV-Ⅱ的直接灭活作用,以及药物抗HSV-Ⅱ对细胞的吸附和对HSV-Ⅱ在细胞内复制增殖的抑制,算出药物抗HSV-Ⅱ的治疗指数。结果大青叶提取物在体外对HSV-Ⅱ无直接灭活作用,也无抗HSV-Ⅱ吸附细胞的作用,但能抑制HSV-Ⅱ在细胞内的复制增殖,其治疗指数达3.56。结论大青叶提取物在体外有一定的抗HSV-Ⅱ感染效果,主要是通过抑制病毒在细胞内的复制增殖而发挥作用。

下调细胞P21^(WAF1/CIP1)基因表达可抑制单纯疱疹病毒Ⅱ型复制

为了揭示细胞P21蛋白在单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type2,HSV-2)复制中的作用,通过用HSV-2感染和感染前用特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制P21基因表达,应用Western印迹方法检测宿主细胞和病毒蛋白水平,用终点滴定法测定病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)等3个方面,揭示细胞P21蛋白水平的变化对病毒复制的影响.结果表明,HSV-2在细胞内复制时可引起P21蛋白水平增高;而用特异性siRNA下调细胞P21基因表达时,可显著地抑制HSV-2gB蛋白水平,减少培养细胞上清液中病毒TCID50.提示P21蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.

知母宁的体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型作用

目的检测知母宁体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSVⅡ)作用。方法以Vero细胞为宿主细胞,阿昔洛韦为阳性对照药物,采用中性红染色法测定不同药物加入方式下知母宁的体外抗HSVⅡ有效率,并检测其抑制病毒作用的时效关系及对病毒感染性的影响。结果知母宁表现出对HSVⅡ333的综合抑制作用和抑制病毒吸附后的后续复制增殖作用,其抗病毒有效率(ER%)最高达80%,这两种作用的半数有效浓度(EC50)均约为0.8mg/ml。知母宁浓度≥2.08mg/ml时能显著抑制HSVⅡ,ER%最高达95%。知母宁还有较弱的预防病毒吸附作用。知母宁抗病毒作用的时效关系研究表明,随药物作用时间延长,低浓度药物抗病毒有效率呈减小趋势,在高浓度时(≥2.08mg/ml)其病毒抑制强度基本维持稳定。随药物作用时间延长,知母宁可明显削弱病毒的感染性,知母宁组病毒的-lgTCID50值较病毒对照组的下降值呈增大趋势,其下降百分比维持稳定,约为40%。结论知母宁体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型效果好,且其抗病毒作用具有多个作用点。

靶向UL27shRNA抑制Ⅱ型单纯疱疹病毒在HEK293细胞中的复制

按照shRNA(small hairpin RNA)设计原则,针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type2,HSV-2)的UL27基因序列保守区域筛选设计、合成4条干扰靶序列并构建表达UL27序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pGPU6/GFP/Neo.通过脂质体介导重组表达载体转染HEK293细胞(human embryonic kidney 293 cell)再接种HSV-2.采用实时荧光定量PCR(real-timefluorescent quantitative PCR)技术检测UL27各组的mRNA转录水平,终点滴定法检测细胞上清液中的病毒滴度,四甲基偶氮唑盐(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,Western印迹法检测蛋白表达效果.结果显示,UL27shRNA75组对UL27基因mRNA表达抑制效果最佳,同时能显著抑制感染细胞的CPE(cytopathic effect,CPE),降低上清液中的病毒感染滴度,提高细胞的生存率,抑制UL27基因的蛋白表达.提示本研究构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27表达载体能在细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL27基因表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制.

MEK1-ERKs级联激活方式是调控单纯疱疹病毒Ⅱ型复制的重要机制

本研究通过阐明MEK1和MEK2亚型在单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV2)复制中介导的Raf/MEK/ERK(简称ERK)通路活化中的作用,以期进一步阐明该通路调控病毒复制的机制.研究中应用了MEK抑制剂U0126、针对MEK1和MEK2的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),以及用死、活病毒攻击易感细胞,分别检测细胞ERK通路的激活和病毒复制的水平.结果表明,HSV2活病毒感染能引起ERK通路双相激活,U0126则能有效地抑制该通路的活化以及病毒复制;而死病毒只能引起ERK通路早期时相激活;单独敲降(knockdown)MEK1可抑制死、活病毒引发的ERK通路早期时相激活及活病毒引发的晚期时相激活,而敲降MEK2未见对病毒引起的该通路双相激活产生显著影响.提示HSV2复制引起ERK通路双相激活是基于MEK1-ERKs方式调控的,这种信号蛋白激活传递模式在HSV2整个复制周期中具有重要的正调控作用.该结果进一步证明了本室的前期报道:MEK1和MEK2亚型在病毒复制时发挥的作用不同.这对揭示MEK激酶功能的复杂性和ERK通路调控HSV2复制的机制,具有重要的意义.

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.

中药黄白液抑制Ⅱ型单纯疱疹病毒复制的实验研究

目的 :探讨黄白液治疗预防复发性生殖器疱疹的作用。方法 :采用体外细胞培养技术观察黄白液对Ⅱ型单纯疱疹病毒 (HSV 2 )复制的抑制作用 ,并与环胞苷、阿昔洛韦作比较。结果 :黄白液对HSV 2的复制有明显抑制作用 ,其最小有效浓度为2 .5g·L- 1 ,治疗指数为 3 ,黄白液 2 .5g·L- 1 对HSV 2的抑制作用不亚于环胞苷 ,两者抑毒指数为 2 .83 ,阿昔洛韦抗HSV 2作用较强 ,抑制指数为 5 .3 1。结论 :黄白液可治疗复发性生殖器疱疹 ,与其抑制HSV

青羊参多糖硫酸酯体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型活性研究

目的体外测定青羊参多糖硫酸酯抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的活性。方法采用MTT法检测化合物对疱疹病毒感染Vero细胞的保护作用。结果青羊参多糖硫酸酯体外抗HSV-Ⅱ的EC50为69.9μg/m l,治疗指数为103。结论在体外,青羊参多糖硫酸酯有较显著的抗HSV-Ⅱ的作用。

单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗的免疫研究

目的 构建新型单纯疱疹病毒Ⅱ型DNA疫苗 ,鉴定其在哺乳细胞中的表达 ,检测其激发动物产生免疫反应的能力。方法 RT -PCR鉴定gD基因在COS - 7细胞中的表达 ,ELISA检测血清中中和抗体水平 ,用病毒攻击后检测其保护效率。结果 pVAX -gD能在COS- 7细胞中表达 ,并可激发免疫动物产生高滴度中和抗体 ,有效保护动物免受致死量病毒的攻击。

藏药甘青乌头生物碱抗单纯疱疹病毒Ⅱ型体内外作用

目的探讨藏药甘青乌头脂溶性生物碱（ALA）和水溶性生物碱（AWA）抗单纯疱疹病毒Ⅱ型（HSV-2）的作用和机制。方法四甲基偶氮唑蓝法测定细胞毒性,细胞病变作用法和蚀斑法测定甘青乌头生物碱体外抗HSV-2活性,以半数有效浓度和治疗指数为评价指标;荧光定量聚合酶链式反应法（FQ-PCR）和蚀斑法考察ALA和AWA体外抗HSV-2作用机制。用HSV-2建立小鼠脑炎模型,对AWA体内抗HSV-2的活性进行评价。结果 ALA和AWA对Vero细胞的半数中毒浓度分别为3.57和7.87mg/mL。ALA和AWA半数有效质量浓度分别为4.99和2.81 mg/mL,治疗指数分别为0.72和2.80。ALA和AWA均能直接灭活HSV-2,能够显著抑制HSV-2的感染性。ALA对吸附到非洲绿猴肾细胞的HSV-2没有抑制作用,能微弱抑制HSV-2大分子的增殖,对HSV-2 DNA的复制没有作用。AWA能够抑制HSV-2吸附,抑制HSV-2大分子的增殖,抑制HSV-2 DNA的合成,抑制倍数达10~2。AWA对小鼠的半数中毒质量浓度为0.28mg/kg。AWA延长了小鼠的平均存活时间,对小鼠的死亡显示出10%的保护率。结论 AWA抗HSV-2的活性大于ALA,ALA主要通过直接灭活HSV-2,AWA通过抑制HSV-2复制循环的各个环节起作用。

喷昔洛韦对单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的抑制作用

目的 评估喷昔洛韦钠盐在体内外对HSV Ⅰ和HSV Ⅱ感染的抑制作用。方法 在组织培养中用CPE抑制实验测定喷昔洛韦钠盐对HSV Ⅰ和HSV Ⅱ所致vero细胞病变的抑制作用 ;在BALB/c小鼠中测定其对HSV Ⅰ感染BALB/c小鼠所致耳部皮损的治疗作用。结果 喷昔洛韦钠盐能有效抑制 10 0TCID50 HSV Ⅰ (sm44株 )和HSV Ⅱ (3 3 3株 )感染vero细胞所产生的细胞病变作用 ,半数有效剂量 (IC50 )分别为 1.95 μg/ml和 3 .90 μg/ml ;使HSV Ⅰ病毒感染性滴度下降 99%的药物浓度 (IC99)为 2 .40 μg/ml。在HSV Ⅰ (sm44)感染BALB/c小鼠中 ,喷昔洛韦钠盐大剂量组 (2 5 0mg/kg·d)、中剂量组 (10 0mg/kg·d)、小剂量组 (5 0mg/kg·d)均能明显降低HSV Ⅰ感染BALB/c小鼠所致耳部皮损作用。 结论 喷昔洛韦钠盐在体内外具有抗HSV Ⅰ和HSV Ⅱ感染的作用。

Ⅱ型单纯疱疹病毒培养及gG-2基因特异片段的克隆

目的:通过培养和扩增Ⅱ型单纯疱疹病毒(HSV-2)并提取其全基因组,从而克隆包膜糖蛋白gG-2全长基因及其保守性较高、抗原性较强的特异片段。方法:将HSV-2病毒感染Hela细胞获得大量病毒液,用酚-氯仿法提取病毒全长基因组,并以此为模板扩增编码gG-2的US4基因,再根据氨基酸序列比对结果,选取其特异片段,设计带酶切位点的引物克隆gG-2基因特异片段。结果:成功地获得了大量HSV-2病毒液并提取了病毒基因组,克隆了gG-2全长基因以及特异片段,测序证实,两者均与GenBank中报道的序列相一致。结论:对于遗传特性相对稳定的HSV-2来说,通过病毒感染细胞的方法短时期内获得大量病毒液,并从病毒全基因组中克隆gG-2特异基因片段的方法是可行的,从而为进一步构建gG-2特异片段相关载体、表达相应蛋白奠定了基础。

樟芝提取物体外抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的初步研究

樟芝是台湾特有的珍稀药用真菌,具有抗癌、抗炎、抗病毒等多种功效。为了考察液体发酵樟芝菌丝体水提取物和乙醇提取物对单纯性疱疹病毒II型的抑制作用,本文采用MTT法测定樟芝提取物对细胞的毒性和对病毒的抑制作用。试验结果表明樟芝水提取物和乙醇提取物对Vero细胞有微弱毒性,但是1.5mg/mL的乙醇提取物和2.5mg/mL的水提取物对细胞基本无毒性,二者对单纯疱疹病毒Ⅱ型均有抑制作用,其半数抑制浓度(IC50)分别为0.30mg/mL和1.32mg/mL。樟芝水提取物和乙醇提取物在体外对单纯疱疹病毒均有显著的抑制作用。

全长单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D毕赤酵母表达载体的构建

目的:构建单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)糖蛋白D(gD)的毕赤酵母表达载体,为进一步研制重组抗原诊断试剂、研究亚单位疫苗奠定基础。方法:PCR从HSV-2基因组中扩增gD2基因,再用PCR的方法在基因两端加入两个限制性内切酶切位点XhoⅠ和XbaⅠ;PCR产物经过双酶切后按照正确的读码框顺序克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中;转化到大肠杆菌感受态细胞TOP10F'中,抗生素得到筛选转化子。结果:核酸序列测定PCR扩增的gD2片段与GeneBank中HSV-2G株gDDNA碱基同源性达98.4%,氨基酸同源性达95.7%。在实验过程中构建了四个表达载体,经过双酶切后琼脂糖电泳鉴定正确。结论:构建了gD2毕赤酵母表达载体四个,其中两个含有HSV-2gB的CTL表位序列。

Ⅱ型单纯疱疹病毒糖蛋白D在杆状病毒表达系统中的表达

以Ⅱ亚单纯疱疹毒-2333株(HSV-2)的基因组DNA为模板扩增编码HSV-2糖蛋白D(glyco-protein D)基因,与载体pFastBacⅠ连接,转化E.coilDH5α感受态细胞,经PCR及测序鉴定正确。将pFastBacⅠ-gD重组质粒转座至DH10Bac获得重组穿梭质粒,转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。重组杆状病毒感染Sf9细胞表达重组蛋白,经对表达条件进行优化,SDS-PAGE和Western blot鉴定,成功表达HSV-2 gD蛋白,为下一步的工作奠定了基础。

一株红树林真菌抗单纯疱疹病毒Ⅱ型的研究

目的对分离自海南红树林真菌菌株PH1018的胞外多糖(Exopolysaccharide,EPS)抗单纯疱疹病毒Ⅱ型(Herpes simplex virus type 2,HSV-2)活性进行研究。方法收集纯化菌株PH1018产生的EPS,体外采用细胞病变观察EPS的细胞毒性和抗HSV-2作用。为观察EPS对HSV-2体内感染的治疗效果,小鼠颅内注射0.02 ml 滴度为 100 LD 50 /0.1 ml -1的HSV-2,24 h后以不同浓度EPS灌胃,持续7 d,14 d后计算小鼠存活率和存活时间。菌株分类采用形态学观察和ITS序列分析。结果 EPS可抑制HSV-2病毒活性,病毒感染的细胞病变的半抑制浓度(Inhibited concentration,IC50)为 313 μg/ml,SI 为 11.43。EPS 25 mg·kg-1·d-1灌胃后,小鼠存活率为40.0%,存活时间为(9.82±1.87)d,相比模型组实验动物存活时间和存活率均有提高。菌株初步鉴定为杂色曲霉。结论从海南红树林分离一株杂色曲霉,其产生的EPS具有抗HSV-2活性,值得进一步研究。

单纯疱疹病毒Ⅱ型抗原优势表位与乙肝核心蛋白融合DNA疫苗的构建

提取HSV-2333株的DNA作为模板,用PCR方法扩增编码HSV-2糖蛋白D抗原优势表位的基因(gDt)和乙肝核心蛋白(HbcAg)的基因序列(HBc),再用重叠PCR方法将gDt插入到HBc编码Hb-cAg刺突部的第81和82位的氨基酸的基因之间,获得融合基因gDt-HBc,将gDt-HBc插入真核表达质粒pcDNA3.1中,构建出真核表达质粒gDt-HBc-pcDNA3.1,转化DH5a感受态细胞后,通过菌落PCR和双酶切鉴定后进行测序鉴定,测序结果与预期结果完全一致,成功构建单纯疱疹病毒Ⅱ型抗原优势表位与乙肝核心蛋白融合DNA疫苗,为下一步的评价工作奠定了基础。