胶质瘤的单纯疱疹病毒胸腺激酶基因治疗

胶质瘤是颅内最常见的原发恶性肿瘤，约占成人原发脑肿瘤的30％，年发病率约为14．7/10万人．虽然在神经外科技术、放射与化学治疗等方面近年已有很大的进展，但胶质瘤的预后并无明显的改善，5年生存率仍<5．5％．近几年，许多学者提出胶质瘤的基因治疗．

靶向非病毒载体一次及持续介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因转导卵巢癌细胞的比较

目的比较靶向非病毒载体GE7系统介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV1-tk)基因一次及持续转导卵巢癌细胞的转导效率及杀伤效应。方法靶向非病毒载体系统GE7分别与标志基因β-半乳糖苷酶(β-gal)基因和治疗基因HSV1-tk基因构成载体复合物,一次及持续体外转导卵巢癌细胞CaOV3,通过5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖甙(X-gaI)染色比较GE7系统一次及持续转导外源基因的转导效率。将丙氧鸟苷(GCV)加入一次及持续转导HSV1-tk基因的卵巢癌细胞,通过细胞生长抑制曲线、流式细胞分析等,观察GCV对一次及持续转导GE7/HSV1-tk的卵巢癌细胞的杀伤作用。结果X-gal染色显示,GE7-次转导外源基因的平均转导效率可达80%,持续转导达85%。当GCV为1μg/mL时,GE7/HSV1-tk一次转导的生长抑制率达82%,凋亡指数为15,而持续转导可达90%,凋亡指数为30。在相同的GCV浓度下,持续转导GE7/pCMV-tk卵巢癌细胞生长抑制率显著高于一次转导(P<0.05)。结论GE7载体系统持续转导卵巢癌细胞较一次转导的平均转导效率高,持续转导的GE7/HSV1-tk/GCV基因治疗系统杀伤作用更大。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因联合更昔洛韦治疗肿瘤的机制

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)与抗病毒药物更昔洛韦(GCV)组成的药物敏感基因疗法在肿瘤基因治疗领域中引人注目,它产生的旁观者效应在一定程度上弥补了基因载体转染率不高的问题,在肿瘤自杀基因疗法中发挥着重要的作用,现对HSV-TK/GCV治疗肿瘤机制及其应用趋势作一综述。

联合应用全反式维甲酸与单纯疱疹病毒腺苷激酶基因对髓母细胞瘤的协同杀伤作用研究

目的评估全反式维甲酸(ATRA)联合单纯疱疹病毒腺苷激酶(HSV-tk)基因对髓母细胞瘤细胞系Daoy的杀伤作用。方法观察不同浓度ATRA对Daoy细胞生长的抑制作用;HSV-tk基因稳定转染人的髓母细胞瘤细胞系Daoy,获得Daoy-tk细胞;Daoy-tk细胞与Daoy细胞按不同比例混合,给予不同浓度的更昔洛韦(GCV)和一定浓度的ATRA,7d后应用噻唑蓝(MTT)法测定细胞生存率。结果 ATRA在0.5～1μmol/L时即可对Daoy细胞生长产生抑制作用;Daoy-tk与Daoy细胞比例达到1:4时仍有明显的抗肿瘤作用,联合应用1μmol/L的ATRA后能显著提高HSV-tk基因对Daoy细胞的杀伤率。结论 ATRA与HSV-tk/GCV系统联合应用,能增强对人的髓母细胞瘤的杀伤作用。

全反式维甲酸增强携单纯疱疹病毒胸苷酸激酶基因的超声微泡对SMMC-7721细胞的旁观者效应

目的观察经全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)诱导后,单纯疱疹病毒胸苷酸激酶/丙氧鸟苷系统(HSV-TK/GCV)对人肝癌细胞SMMC-7721旁观者效应的影响。方法免疫组化法观察经全反式维甲酸诱导前后SMMC-7721细胞连接蛋白Cx32的表达;将含有HSV-TK基因的质粒通过静电吸附在脂质微泡表面上,采用超声辐照转染并用倒置显微荧光镜及RT-PCR观察TK基因的转入及表达;MTT法观察经全反式维甲酸诱导后HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应。结果经全反式维甲酸诱导后SMMC-7721细胞膜上Cx32表达明显增加,而胞质内仅少量表达;通过超声辐照后HSV-TK基因可顺利转入SMMC-7721细胞中并稳定表达;与对照组相比,经全反式维甲酸诱导组可明显提高HSV-TK/GCV对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应(P<0.05)。结论全反式维甲酸可提高SMMC-7721细胞中连接蛋白Cx32的表达且能正确定位于细胞膜上,这可能与其能增强HSV-TK/GCV系统对肝癌细胞SMMC-7721的旁观者效应有关。

人端粒酶逆转录酶启动子调控腺病毒介导胸苷激酶基因治疗人膀胱癌的动物实验研究

目的:探讨带有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)基因的重组腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk结合无毒的环氧鸟苷(GCV)对人膀胱癌的治疗作用。方法:建立人膀胱癌细胞株253JBALB/C裸小鼠移植瘤模型,采用Ad-hTERT-HSV-tk裸鼠尾静脉注射,腹腔注射GCV治疗并观察结果。通过常规病理切片观察肿瘤破坏情况及安全性;通过TUNEL染色进一步观察肿瘤的凋亡情况,免疫组化法测定增值细胞核抗原(PCNA)。结果:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组,显示出明显的肿瘤抑制作用,其肿瘤体积、重量显著低于各对照组(P<0.05),抑瘤率明显。Ad-hTERT-HSV-tk/GCV治疗组凋亡指数高于其它各组,而增殖指数却明显低于其它各组。结论:Ad-hTERT-HSV-tk/GCV系统对裸鼠移植瘤的生长有明显抑制作用,可以靶向性转入人膀胱癌细胞,治疗效果显著。

HSV对Carbocyclic Oxetanocin G的耐药性及耐药病毒的胸腺嘧啶核苷激酶的活性研究

目的探讨治疗疱疹病毒性角膜炎的新药CarbocyclicoxetanocinG(C.OXTG)耐药性的产生情况及产生耐药性的机制。方法将1型单纯疱疹病毒(HSV1)接种于非洲绿猴肾细胞,在含10μmol/LC.OXTG的环境中连续培养20代,通过空斑抑制试验测定各代病毒株对C.OXTG的敏感性,测定野生HSV1、培养20代后的HSV1的耐药性及其生物克隆株的胸腺嘧啶核苷激酶的活性。结果HSV1在含C.OXTG的环境中连续传代培养4代后,便出现了耐药性。培养20代后的病毒株及其克隆株的ED50为野生株的10倍,且病毒的TK酶活性远远低于野生病毒株。结论HSV1在含C.OXTG的环境中很快产生耐药性且耐药病毒株缺乏TK酶活性。

EB病毒特异的胸苷激酶基因在大肠杆菌中的表达

３０℃培养基因工程菌，迅速转移至４２℃培养４ｈ诱导重组质粒中外源ＥＢ病毒胸苷激酶（ＥＢＶＴＫ）基因的表达。菌体蛋白作十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分析表明，重组蛋白分子大小与ＥＢＶＴＫ分子大小的理论值６７ｋｕ相符，占菌体总蛋白的６％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明重组蛋白可与混合ＮＰＣ病人血清中ＥＢＶＴＫ特异性抗体反应，呈现良好的抗原性。以３ＨｄＴ为底物测定菌体总蛋白的ＴＫ比活性，结果提示，重组蛋白具有胸苷激酶活性。研究为ＥＢＶＴＫ在ＮＰＣ诊断中的应用打下了基础。

猫疱疹病毒Ⅰ型环介导等温扩增检测方法的建立

建立一种环介导等温扩增(LAMP)检测方法,实现对猫疱疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的快速、准确、简便检测。根据Gen Bank中FHV-1的TK基因设计引物,优化反应条件,通过琼脂糖凝胶电泳和SYBR GreenⅠ染色观察分析扩增效果。该方法特异性好,敏感性检测实验表明该检测方法最低能够检测到的模版是101copies/μL,是PCR检测方法灵敏度的10倍。金属浴、烘箱、恒温水浴锅与PCR仪四种不同的扩增反应仪器均可达到LAMP的要求,扩增出梯形条带。建立了针对FHV-1的LAMP检测方法,该种检测方法具有高特异性的扩增引物,对检测的仪器、反应条件及检测人员技术要求比较宽松,从扩增开始到通过SYBR GreenⅠ实现的结果可视化解读所用时间不到1 h,实现了快速、准确、简便检测FHV-1的目的。

动脉灌注GE7系统介导1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶／羟甲基无环鸟苷对大鼠诱发性卵巢恶性肿瘤的作用

目的观察非病毒载体介导1型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶（HSVl-tk）／羟甲基无环鸟苷（GCV）基因治疗系统，经肿瘤供血动脉灌注，对大鼠诱发性卵巢癌的作用，并初步探讨其作用机制。方法构建GE7-polylysine／pCMV-HSVl-tk／polylysine-HA20四元复合物，取二甲基苯蒽（DMBA）诱发的大鼠卵巢肿瘤模型18只，随机分为3组，每组6只。分别经卵巢供血动脉注入四元复合物8“g／只（Atk组）、同体积的生理盐水（ANS组），经尾静脉注入四元复合物8μg／只（Vtk组）。72h后，3组大鼠均腹腔注射GCV，50mg·kg-1.d-1，连用10d。停药后3d处死大鼠，瘤体称重，计算抑瘤率。采用流式细胞仪检测各组大鼠卵巢肿瘤细胞的细胞周期变化和细胞凋亡情况。结果Atk组大鼠肿瘤瘤重为（4．774-2．31）g，明显低于ANS组[（14．66±6．26）g，P〈0．01]和Vtk组[（17．53±7．19）g，P〈0．01]。Atk组抑瘤率为67．5％Vtk组的抑瘤率为-19．6％。流式细胞检测结果显示，Atk组S期细胞占（54．32±9．65）％，高于ANS组[（27．434-9．22）％，P〈0．01]和Vtk组[（30．16±11．57）％，P〈0．01]。Ark组肿瘤细胞凋亡率为（39．15±12．16）％，高于ANS组[（11．864-5．28）％，P〈0．01]和Vtk组[（14．32±6．43）％，P〈0．01]。结论HSVl-tk在GE7导人系统介导下，经卵巢供血动脉导人大鼠卵巢肿瘤组织，给予GCV后，可使肿瘤细胞阻滞于S期，促进肿瘤细胞凋亡，从而发挥良好的抑瘤作用。

非病毒载体介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因治疗卵巢癌的体外研究

目的 探讨靶向非病毒载体GE7在卵巢癌细胞株CAOV3细胞中的转导效率 ,及其介导的Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 (HSV1 tk) /更昔洛韦 (GCV)基因治疗系统在卵巢癌治疗中的应用。方法 构建由表皮生长因子受体 (EGFR)介导的非病毒载体GE7,分别与外源基因 [即报告基因 β 半乳糖苷酶 (β gal)和治疗基因HSV1 tk]构成载体复合物 ,体外转导CAOV3细胞 ,通过 5 溴 4 氯 3 吲哚 β D半乳糖苷 (X gal)染色、核酸分子印记杂交分析 ,观察非病毒载体GE7对外源基因 β gal及HSV1 tk基因的转导情况 ;将GCV加入转导HSV1 tk基因的CAOV3细胞 ,通过细胞生长抑制曲线、流式细胞仪分析等 ,观察其对肿瘤细胞的杀伤作用。结果 β gal基因的转导效率可达 80 % ,呈瞬时表达 ;加入 10mg/L的GCV时 ,转导HSV1 tk基因的CAOV3细胞的生长抑制率可达 95 % ;流式细胞仪分析显示 ,CAOV3细胞S期比例上升 ,最高达 90 % ,凋亡指数高达 30。结论 GE7载体系统能高效地将外源基因导入CAOV3细胞 ,GE7/HSV1 tk /GCV基因治疗系统在卵巢癌治疗中可能具有良好的应用前景。

单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因对人胰腺癌细胞的杀伤作用

构建了能表达单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶（ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＨＳＶ－ＴＫ）的逆转录病毒质粒ｐＮＴＫ，经病毒包装细胞ＰＡ３１７包装后成为具有感染力的重组病毒，用该病毒感染人胰腺癌细胞系ＰＣ－２细胞，经Ｇ４１８筛选得到稳定的转化细胞系。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交证实转化ＰＡ３１７细胞及转化的ＰＣ－２细胞中均有重组病毒的表达。ｐＮＴＫ转化的ＰＣ－２细胞能使无毒性前身药物ａｃｙｃｌｏｖｉｒ（无环鸟苷，ＡＣＶ）或ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）具有明显的细胞毒性，细胞杀伤率＞９０％，而对照组ＰＣ－２细胞杀伤率＜１０％。同时还观察到“旁观者效应”现象。

动脉灌注GE7系统介导Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因导入大鼠卵巢癌细胞

目的 采用大鼠诱发性卵巢癌模型,观察经肿瘤动脉灌注结合GE7导入系统对Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（HSV1-tk）转导的效率和靶向性.方法 构建GE7四元复合物,将诱发的荷瘤大鼠9只随机分成A组、B组和C组,A组经卵巢动脉注入四元复合物（8μg/只）,B组注入同体积生理盐水,C组经尾静脉注入四元复合物（8μg/只）.给药72 h后,分别以逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测大鼠的肿瘤、心、肝、脾、肺及肾脏组织的HSV1-tk mRNA及蛋白的表达.结果 A组肿瘤组织中HSV1-tk mRNA和蛋白均高表达,而其他组织中则无表达或表达极少 B组未见HSV1-tk mRNA及蛋白的表达 C组肿瘤组织中未见HSV1-tkmRNA和蛋白的表达,肝脏、脾脏、肺脏及肾脏组织中则有少量的表达.RT-PCR半定量检测结果显示,A组卵巢肿瘤组织中的HSV1-tk mRNA含量（1.692±0.221）明显高于C组卵巢肿瘤组织（0.012±0.002 P〈0.01）.结论 动脉灌注结合GE7导入系统对HSV1-tk有较高的转导率和靶向性,为HSV1-tk/GCV治疗系统在卵巢癌基因治疗的应用提供了新的策略.

胸腺五肽辅助治疗疱疹性唇炎疗效观察

目的观察胸腺五肽辅助治疗疱疹性唇炎的临床效果。方法选取2013年6月至2014年12月在武警海南边防总队医院就诊的疱疹性唇炎患者80例,按随机数表法分为对照组和观察组,每组40例。两组患者均给予抗病毒药物治疗,观察组加用胸腺五肽;比较两组患者治疗后的临床疗效,症状和体征好转的时间,随访一年,记录患者的复发情况。结果观察组患者的治疗总有效率为92.5%,明显高于对照组的72.5%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者的临床症状消失时间、疱疹结痂时间、临床愈合时间分别为(1.91±0.82)d、(3.34±1.02)d、(4.80±1.14)d,均短于对照组的(3.24±1.15)d、(5.78±1.36)d、(8.51±1.92)d,差异均有统计学意义(P<0.05);1年内观察组患者的复发率为27.5%,明显少于对照组的65.0%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论胸腺五肽联合抗病毒药物治疗疱疹性唇炎具有疗程短、起效快、复发率低的优点。

AFP启动子介导胸苷激酶表达载体的构建及其特异性表达

【目的】构建AFP启动子介导HSV-TK基因表达载体,并对其在肝癌细胞中特异性表达进行分析。【方法】采用PCR法扩增人AFP基因启动子。回收纯化后克隆入pBluescript Ⅱ KDR-TK相同克隆位点,切取AFP-TK片段,然后通过酶联反应插入到pEGFP-C1中,构建成pEGFP-C1-AFP-TK。对获得的片段进行鉴定、细胞靶向和外源基因表达的鉴定。【结果】序列分析表明,该启动子含300bp核苷酸,与已报道的序列比较,100%相符。限制性酶切分析,重组质粒pEGFP-C1-AFP-TK已经克隆AFP启动子。RT-PCR及Western blotting分析pEGFP-C1-AFP-TK转染后的HepG2细胞后,表明TK基因在mRNA水平上能有效的表达,裂解后的HepG2细胞膜蛋白中有相对分子质量约61～83ku大小的特异性条带。【结论】人肝细胞癌(HepG2)靶向性质粒pEGFP-C1-AFP-TK构建成功。

腺相关病毒介导HSV-tk/GCV系统对晶状体上皮细胞的旁观者效应及机制

目的研究2型重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus2,rAAV2)载体介导的单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-tk/GCV)系统对体外培养兔晶状体上皮细胞(N/N1003A)的旁观者效应,并初步探讨其机制。方法 rAAV2载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent,EGFP)转染体外培养N/N1003A细胞,倒置荧光显微镜观察细胞中EGFP的表达,流式细胞仪检测病毒的转染效率。重组病毒rAAV2/HSV-tk转染体外培养的N/N1003A细胞(N/N1003A-tk),以不同比例与没有转染的细胞混合,MTT法观察旁观者效应;MTT法检测N/N1003A-tk/GCV处理的条件培养液(CM)对N/N1003A细胞的作用。应用相差显微镜、透射电镜观察条件培养液对N/N1003A细胞形态学和超微结构的影响。结果 rAAV2载体能介导EGFP基因稳定转染N/N1003A细胞,转染效率最高达81.12%。当N/N1003A-tk细胞以不同比例(10%、20%、40%、80%、100%)与N/N1003A混合时,细胞抑制率分别为49.00%±0.49%、54.71%±1.41%、59.26%±1.13%、68.20%±0.76%、73.44%±1.26%,与对照组(1.68%±0.45%)比较,差异均有显著统计学意义(均为P<0.01)。N/N1003A-tk/GCV处理的条件培养液可明显杀伤N/N1003A细胞,但将其用0.22μm滤膜过滤后,对细胞的杀伤作用消失。条件培养液处理的N/N1003A细胞出现凋亡征象。结论 rAAV2介导的HSV-tk/GCV系统对兔晶状体上皮细胞有较强的旁观者效应,通过非细胞接触方式诱导旁观者细胞凋亡可能是其机制之一。

单纯疱疹病毒腺苷激酶基因对髓母细胞瘤杀伤作用的研究

目的评估单纯疱疹病毒腺苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase,HSV-tk)基因对髓母细胞瘤细胞系Daoy的杀伤作用。方法 HSV-tk基因稳定转染人的髓母细胞瘤细胞系Daoy,获得Daoy-tk细胞;Daoy-tk细胞与Daoy细胞按不同比例混合,给予不同浓度的更昔洛韦(ganciclovir,GCV),7天后应用噻唑蓝(MTT)法测定细胞生存率。结果 Daoy-tk在GCV浓度为3μg/ml时,即可对Daoy细胞产生最大杀伤作用;Daoy-tk与Daoy细胞比例达到1:4时Daoy-tk仍有明显的抗肿瘤作用。结论 HSV-tk/GCV系统对人的髓母细胞有明显的杀伤作用。

羟甲基无环鸟苷对携有单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因人卵巢癌裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用

据《中华妇产科杂志》1997年12月32卷第12期报道 上海医科大学妇产科医院徐丛剑等,为观察羟甲基无环鸟苷（GCV）对携有Ⅰ型单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶基因（HSV1-tk）的人卵巢上皮癌AO细胞的体内杀伤效应。

自杀基因TK腺相关病毒载体的构建及其抑制肿瘤细胞的功能研究

目的探讨腺相关病毒（rAAV）-单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（herpes simplex virus thymidinekinase,HSV-TK）（简称rAAV-TK）载体的构建及其生物学效应的初步鉴定。方法用PCR扩增TK序列至pAAV-MCS载体,构建pAAV-TK;采用AAV-Helper Free System包装系统、＂氯仿-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提＂及冰乙醇沉淀法进行AAV的包装、纯化和浓缩,对病毒颗粒进行鉴定;用MB49-PSA细胞对rAAV-TK生物学效应进行初步鉴定。结果成功构建pAAV-TK载体,并经酶切、PCR及测序验证其准确性;rAAV病毒颗粒滴度达2×1010 v.p/mL,浓缩后可达到2×1011~2×1012 v.p/mL;rAAV-TK可以分泌TK基因,加入药物更昔洛韦（Ganciclovir,GCV）和吉地他滨（Gemcitabine,GVC）,该基因能有效诱导膀胱肿瘤细胞MB49-PSA凋亡。结论成功构建rAAV-TK腺相关病毒,体外实验表明rAAV-TK/GVC/GCV系统能高效诱导膀胱肿瘤细胞的凋亡。