抗单纯疱疹病毒1型的IgY制备及其生物学活性检测

目的:制备抗单纯疱疹病毒1型(HSV-1)的卵黄抗体(IgY),探讨该抗体的生物学活性,阐明其抗HSV-1的能力。方法:制备HSV-1灭活疫苗,采用鸡胸多点注射法免疫高产蛋鸡,采用聚乙二醇-6000(PEG-6000)法提纯IgY,采用间接ELISA法、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术和蛋白浓度定量试剂盒测定IgY效价、纯度及蛋白水平,采用间接ELISA法检测IgY中和病毒的能力,测定病毒阻断率,以Vero细胞为病毒感染靶细胞,测定不同抗体浓度(0.01560、0.03125、0.06250、0.12500、0.50000、和1.00000 g·L^(-1))作用后细胞病变效应(CPE),根据CPE程度测定IgY体外抗HSV-1能力。结果:制备的IgY效价随免疫时间逐渐升高,达到1/1024000后保持稳定;IgY轻链重链条带清晰;IgY平均蛋白水平为11.544 g·L^(-1);IgY对HSV-1的阻断率可高达77.90%;HSV-1致CPE程度随抗体浓度升高而逐渐降低,当IgY浓度达到0.50000g·L^(-1)及以上时,25%以下细胞(甚至无细胞)发生病变。结论:成功制备出抗HSV-1的IgY,该抗体对HSV-1具有明显的中和阻断能力和体外抑制活性,可用于药物及诊断方法的开发。

家庭聚集性单纯疱疹病毒1型感染3例

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type,HSV)1型和2型(分别为HSV-1和HSV-2)引起多种疾病,包括唇疱疹、生殖器疱疹、疱疹间质角膜炎、脑膜炎和脑炎。HSV-1和HSV-2通过密切接触在个体之间传播。大多数人在生命早期通过口腔黏膜获得HSV-1,而HSV-2感染发生较晚,通常通过性传播;HSV与宿主之间的相互作用,特别是与免疫系统的相互作用,决定了感染的结果。HSV感染后可表现为无症状、轻微的亦或是危及生命的。感染病毒后潜伏期长短、何时再激活、及侵犯某一部位与宿主的免疫状态密切相关[1];HSV可通过飞沫、口腔、呼吸道等方式传播,HSV在家庭成员中传播、感染不少见,但在相近时间段发病却不常见,我们报道3例家庭聚集性HSV感染的病例,旨在提高对该病的认识,减少误诊和漏诊。

CT灌注成像辅助诊断单纯疱疹病毒1型脑炎一例

单纯疱疹病毒性脑炎又称急性坏死性脑炎,是由疱疹病毒感染引起的脑实质炎症。CT灌注成像(CTP)可快速显示脑部组织灌注异常及脑组织受损情况,常被用于脑卒中的诊断,而被用于辅助诊断脑炎的文献报道较少。该文报道了1例通过CTP辅助诊断单纯疱疹病毒1型脑炎的59岁男性患者。该例患者起病急,突发右侧肢体抽搐伴发热,且伴有精神症状,不能配合完成MRI,故急行头颅CTP,结果显示其左侧颞叶灌注较右侧增加,不排除病毒性脑炎的诊断,遂于入院12 h内泵注阿昔洛韦抗病毒治疗及予其他对症治疗,患者病情逐渐好转。入院后3 d脑脊液病原体二代测序结果回报,明确诊断为单纯疱疹病毒1型脑炎。

单纯疱疹病毒1型感染致Mollaret脑膜炎继发癫痫发作:1例报道并文献综述

目的:报告1例单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1, HSV-1)感染致Mollaret脑膜炎(Mollaret’s meningitis)继发癫痫发作的病例,旨在提高临床医生对该病的认识。方法:回顾性分析我院确诊的1例Mollaret脑膜炎患者的临床资料,并结合相关文献进行总结。结果:患者临床以反复发热伴头疼,及继发癫痫发作为特点,脑脊液二代测序(next-generation sequencing, NGS)检查发现HSV-1核酸序列阳性,诊断为Mollaret脑膜炎,经抗病毒及对症治疗1周后症状完全缓解。结论:Mollaret脑膜炎是临床少见疾病,由HSV-1感染更是少见,易误诊、漏诊,应提高早期识别率,减少不必要的检查及治疗。

精神分裂症合并1型单纯疱疹病毒性脑炎个案报道及文献复习

单纯疱疹病毒性脑炎是病毒直接侵犯脑组织所致的中枢神经系统感染性疾病,病变脑组织可出现水肿、坏死、软化等改变。病毒通过嗅神经或三叉神经选择性侵犯额颞叶等部位,引起一系列的临床表现。弥漫性脑损害时,更易引起精神病样症状。约1/3~1/2病例以精神障碍为首发或唯一症状,早期易误诊为其他精神疾病。该病例病史长达几十年,突然出现精神行为异常加重,且伴有意识改变,在外院长期诊断为“精神分裂症”,病情变化前规律服用抗精神病类药物治疗,入院后完善腰椎穿刺获取脑脊液送检,最后经基因检测证实为HSE 1型感染,明确诊断精神分裂症合并1型单纯疱疹病毒性脑炎。

构建单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因真核表达载体

从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV -Ⅱ )Sav株感染的Hep - 2细胞培养液和细胞裂解液中提取HSV -II基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法获取胸苷激酶 (TK)基因 ,将获取的DNA片段克隆入真核表达载体pcDNA3中 ,筛选阳性克隆测序 .结果表明 :本研究所获取的HSV -Ⅱ -TK基因全部编码区为 112 8bp ,编码 376个氨基酸 .结果表明 :本研究扩增出HSV -ⅡTK基因的全部编码区序列 ,并成功构建真核表达载体 pcDNA3/TK .

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素融合基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的 对单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因及血管生成抑制素进行基因扩增 ,克隆构建真核表达质粒pcDNA3 /HSV ⅡTK/As。方法 从单纯疱疹病毒Ⅱ型 (HSV Ⅱ )Sav株感染的Hep 2细胞上清液中提取HSV 2基因组DNA ,以此为模板 ,用PCR方法扩增胸苷激酶 (TK )基因 ,将扩增的片段克隆入载体 pcDNA3 中 ,挑取阳性克隆测序。限制性核酸内切酶酶切 pcDNA3 /HSV ⅡTK ,得到目的基因TK ,将其克隆于已构建的真核表达载体 pcDNA3 /As上。结果 HSV Ⅱ TK基因全部编码区为 112 8bp ,基因序列与 genebank中报道相符。新质粒 pcDNA3 /HSV ⅡTK/As经限制性核酸内切酶 (BamHⅠ ,HindⅢ )酶切后得到 70 0bp(As)及 10 0 0bp(HSV ⅡTK)相应基因片段。 结论 本研究成功构建 pcDNA3 /HSV ⅡTK /As真核表达质粒。

单纯疱疹病毒胸苷激酶基因/Ganciclovir系统对脑胶质瘤动物模型的治疗

目的 探讨单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶基因 (HSV1 tk)结合Ganciclovir(GCV)治疗方案 ,在脑胶质瘤动物模型中基因治疗的疗效以及杀伤肿瘤细胞的机制。 方法 采用Southern杂交法 ,证实逆转录病毒载体生产细胞系pN2 A tk VPC(VPC)带有tk基因并稳定整合到基因组DNA上 ;再将VPC与人脑多形性胶质母细胞瘤细胞系DBTRG 0 5MG(0 5MG)分别以 1∶1、1∶4比例混合接种于BALB c裸鼠皮下 (以只接种 0 5MG细胞作为对照 ) ,建立裸鼠皮下胶质瘤动物模型 ,然后腹腔注射GCV治疗 [30mg (kg·d) ],连续 14d ,治疗后 1周 ,取出瘤块作病理组织学分析。 结果 1∶1组瘤块较 1∶4组和对照组明显减小 (P <0 0 1) ,且有 30 %的瘤块完全消失 ,提示HSV1 tk GCV对肿瘤细胞有显著杀伤效应。光镜观察可见 ,1∶1组细胞核固缩、溶解甚至破裂等坏死特征 ,说明HSV1 tk GCV在invivo水平杀伤肿瘤细胞是细胞毒杀伤效应。 结论 HSV1 tk GCV系统能有效杀伤肿瘤细胞 。

单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因旁观者效应的实验研究

目的 :研究单纯疱疹病毒Ⅱ型胸苷激酶基因 (HSV -Ⅱtk)对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1的旁观者效应 .方法 :HSV -Ⅱtk基因通过阳离子脂质体Lipofectin介导 ,体外转染人原发性肝细胞癌SMMC -772 1,孵育 18h .取出细胞及上清液 ,对倍稀释 ( 2× ,4× ,8× ,16× ,3 2× )后分别加入另一 2 4孔板 .结果 :正常SMMC - 772 1细胞的浓度升高 ,亲本细胞的存活率随之降低 ,两者呈明显的负向相关关系 ;细胞组的OD值明显低于上清液组及空白对照组 (P <0 0 1) ;细胞组可见凋亡峰出现 ,而上清液组则无凋亡峰出现 .结论 :HSV -Ⅱtk基因对人原发性肝细胞癌SMMC - 772 1细胞具有旁观者效应 。

余甘子提取物体外抗单纯疱疹病毒1型和2型的初步研究

目的从余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物3种提取物体外筛选抗单纯疱疹病毒1型和2型的活性成分。方法通过观察药物毒性、病毒引起的细胞病变效应、空斑减数法,判断药物的毒性及其抗病毒效应。结果余甘子的醋酸乙酯提取物、甲醇提取物和水提物对于单纯疱疹病毒1型的半数抑制浓度分别为25.28,66.17,100.94μg/ml;余甘子的3种提取物对于单纯疱疹病毒2型的半数抑制浓度分别为31.70,180.3,112.1μg/ml。结论余甘子3种提取物在体外对单纯疱疹病毒1型和2型均有一定的抑制作用。

千金藤素抗单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)初探

目的 :体外测定千金藤素抗单纯疱疹病毒Ⅰ型的作用 ,为筛选新型抗病毒药物提供参考依据。方法 :用不同稀释度的千金藤素抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型对Vero细胞的感染作用 ,4 8h后观察细胞病变 (CPE)效应。结果 :千金藤素能明显抑制HSV 1对Vero细胞的致病变作用 ,使细胞存活率升高。结论 :千金藤素有较显著的抗HSV 1的作用 ,且抗病毒作用是多方面的 ,是一种具有潜在开发前景的药物。

白介素2基因佐剂协同单纯疱疹病毒1型糖蛋白D核酸疫苗免疫诱导的特异性免疫应答

目的研究白介素2(IL-2)cDNA协同单纯疱疹病毒1型(HSV-1)gD核酸疫苗免疫对机体体液免疫和细胞免疫应答的影响,以及在HSV-1病毒角膜攻击时的保护效果。方法利用pcDNA3.1载体分别构建HSV-1糖蛋白D和IL-2的真核表达质粒pgD和pIL-2,体外鉴定其表达。动物实验分为pcDNA3.1空载体对照组、pgD单独免疫组和pgD+pIL-2联合免疫组3组,具体为通过肌肉免疫接种BALB/c小鼠3次,间隔2周,每次接种质粒100μg,第3次免疫后2周,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体滴度并做亚型分析,利用3H-TdR掺入法进行Th细胞增殖实验,ELISA试剂盒检测Th细胞分泌的IL-2、IFN-γ和IL-10水平,耳廓肿胀实验检测迟发型超敏反应(DTH)反应;HSV-1病毒角膜攻击后,裂隙灯显微镜观察角膜上皮病变。结果与pgD单独免疫组相比,pIL-2的协同免疫可以显著提高IgG2a抗体滴度、Th细胞增殖反应和DTH反应,Th细胞分泌IL-2和IFN-γ水平也显著提高,IL-10水平明显下降。在动物保护实验中,pIL-2的协同免疫明显增强了pgD疫苗在病毒攻击时对角膜的保护效果。结论IL-2cDNA的协同免疫可以显著提高pgD核酸疫苗诱导的体液免疫和细胞免疫应答水平,增加核酸疫苗的免疫保护效果。

单纯疱疹病毒1型糖蛋白B基因疫苗的构建

目的 :构建用于治疗和预防单纯疱疹病毒性角膜炎的核酸疫苗 ,探讨单纯疱疹病毒 1型糖蛋白 B(HSV-1gp B)基因作为基因疫苗的可能性。方法 :利用 PCR技术从 HSV- 1SM4 4毒株基因组中扩增出编码 HSV- 1gp B去除 N端部分信号肽序列 (39bp)的基因片断 (2 6 73bp) ,定向插入真核表达质粒 pc DNA3载体中 ,构建出重组真核表达质粒 pc DNA- gp B,并对其进行酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定。结果 :双酶切重组质粒 pc DNA- gp B,电泳可见两条带 ,分别为目的基因 (2 70 0 bp)和线性质粒 pc DNA3(5 4 0 0 bp) ;以重组质粒 pc DNA- gp B为模板进行 PCR扩增 ,在 2 70 0 bp位置扩增出特异的产物 ;测序结果表明 ,克隆基因插入方向正确 ,与 Gen Bank中登录的 HSV- 1F株 gp B基因序列比较 ,同源性达 99.5 %。结论 :利用 PCR技术从 HSV- 1SM4 4株基因组中扩增出编码 HSV- 1gp B去除 N端部分信号肽序列 (39bp)的基因片断 (2 6 73bp) ,成功地构建了 HSV- 1基因疫苗pc DNA- gp B。

槟榔提取物体外抗柯萨奇病毒B3及单纯疱疹病毒1型和乙型肝炎病毒的研究

目的从槟榔9种提取物中体外筛选出抗柯萨奇病毒B3,单纯疱疹病毒1型活性成分,从其中3种提取物中体外筛选出抗乙型肝炎病毒的活性成分。方法通过观察药物毒性、病毒引起的细胞病变效应、MTT法,判断药物毒性及药物抗病毒效应。结果槟榔9种提取物对Hela,Vero细胞具有一定的毒性,而无抗病毒活性,3种提取物不能有效地抑制HepG2.2.15细胞HBeAg的表达。结论槟榔9种提取物体外无抗柯萨奇病毒B3、单纯疱疹病毒1型的作用,3种提取物体外无抗乙型肝炎病毒的作用。

栀子提取物ZG对单纯疱疹病毒1型细胞吸附的影响

采用负染技术,借助高倍电子显微镜观察栀子提取物ZG作用后,病毒颗粒及其病毒吸附蛋白(virus attach-ment protein,VAP)的变化,考察药物是否直接改变或破坏病毒包膜蛋白的结构,使其失去感染性;采用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记病毒,以肝素钠为参照,借助冷却慢扫描电荷耦合器件荧光成象技术,用Aquacomos软件进行图象分析,以探讨栀子提取物ZG不同加药方式对HSV-1吸附量的影响。结果表明栀子提取物ZG对HSV-1包膜表面的VAP无直接破坏作用,不影响病毒对Hep-2细胞的感染性;先加入肝素钠再进行病毒吸附及肝素钠病毒同时加入培养细胞这两种用药方式可明显减少细胞表面病毒的吸附量;栀子提取物ZG各种不同加药方式均能阻止HSV-1对Hep-2细胞表面的吸附,使病毒吸附量减少。

阿昔洛韦治疗单纯疱疹病毒Ⅰ型脑炎小鼠血清一氧化氮、白细胞介素-1β水平变化及病理学观察

目的探讨阿昔洛韦治疗单纯疱疹病毒性脑炎(HSE)小鼠血一氧化氮(NO)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平变化及病理学改变。方法建立单纯疱疹病毒-1(HSV-1)感染的小鼠病毒性脑炎模型,将模型分为未治疗和阿昔洛韦治疗组,同时设正常对照组,比较各组小鼠病死率、血清NO、IL-1β水平变化和电镜下小鼠神经细胞形态结构变化。结果模型组小鼠脑组织HSV-1DNA均为阳性,正常对照组为阴性;电镜下模型组神经细胞内可见HSV-1病毒颗粒;阿昔洛韦治疗组小鼠死亡率、血清NO及IL-1β水平均比未治疗组明显降低,差异有显著性(Pa<0.01);电镜下阿昔洛韦治疗组小鼠神经细胞,髓鞘病变均较轻。结论阿昔洛韦可能通过降低单纯疱珍病毒Ⅰ型脑炎小鼠血清NO、IL-Iβ水平,减轻神经细胞的炎症反应及细胞因子引起的神经毒性作用,达到对神经细胞的保护作用。

MEK1-ERKs级联激活方式是调控单纯疱疹病毒Ⅱ型复制的重要机制

本研究通过阐明MEK1和MEK2亚型在单纯疱疹病毒Ⅱ型(herpes simplex virus type 2,HSV2)复制中介导的Raf/MEK/ERK(简称ERK)通路活化中的作用,以期进一步阐明该通路调控病毒复制的机制.研究中应用了MEK抑制剂U0126、针对MEK1和MEK2的特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),以及用死、活病毒攻击易感细胞,分别检测细胞ERK通路的激活和病毒复制的水平.结果表明,HSV2活病毒感染能引起ERK通路双相激活,U0126则能有效地抑制该通路的活化以及病毒复制;而死病毒只能引起ERK通路早期时相激活;单独敲降(knockdown)MEK1可抑制死、活病毒引发的ERK通路早期时相激活及活病毒引发的晚期时相激活,而敲降MEK2未见对病毒引起的该通路双相激活产生显著影响.提示HSV2复制引起ERK通路双相激活是基于MEK1-ERKs方式调控的,这种信号蛋白激活传递模式在HSV2整个复制周期中具有重要的正调控作用.该结果进一步证明了本室的前期报道:MEK1和MEK2亚型在病毒复制时发挥的作用不同.这对揭示MEK激酶功能的复杂性和ERK通路调控HSV2复制的机制,具有重要的意义.

细胞MEK1/2蛋白及其相关通路在单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制中的作用

基于细胞Raf/MEK/ERK信号通路与病毒复制的关系,应用Western印迹检测p-ERK1/2蛋白的表达、用终点滴定法测定病毒增殖量(TCID50),以及观察感染细胞的细胞病变效应(CPE)等,揭示单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)复制与ERK通路的关系.结果表明,HSV-2的复制可引起细胞ERK通路的活化;用U0126预先抑制ERK通路的活化,或用特异性siRNA敲减MEK1/2基因的表达可显著地抑制病毒复制.提示ERK信号通路以及MEK1/2蛋白对HSV-2的复制具有重要的作用.该研究对进一步阐明细胞ERK通路各激酶蛋白在病毒复制中的作用机制、寻找抗病毒作用靶标等奠定了良好的基础.

单纯疱疹病毒II型CTL表位DNA疫苗的Th1/Th2免疫应答研究

目的探讨单纯疱疹病毒II型(HSV-2)CTL表位疫苗对小鼠Th1/Th2型免疫应答的影响。方法用构建的HSV-2pVAX-gD-CTL重组质粒免疫BALB/c小鼠3次,末次免疫后第4周检测小鼠血清中gDIgG水平;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况;ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清中INF-γ,IL-4水平;流式细胞仪测定小鼠CD4+,CD8+T淋巴细胞亚群。结果HSV-2pVAX-gD-CTL疫苗免疫小鼠后可以诱导脾淋巴细胞增殖及分泌INF-γ和IL-4,诱导CD4+,CD8+T细胞百分比的升高;并能刺激血清HSV-2gD特异性抗体的产生。其中pVAX-gD-CTL组在脾淋巴细胞刺激指数及其分泌INF-γ水平、CD4+,CD8+T细胞百分比升高方面均显著高于pVAX-gD对照组。结论CTL表位对单纯疱疹II型重组DNA疫苗诱导的Th1型免疫应答有促进作用。

一种1型单纯疱疹病毒载体系统的建立

1型单纯疱疹病毒(HSV-1)作为溶瘤病毒和病毒载体的研究已有很长的历史.本研究利用细菌人工染色体技术建立了一种HSV-1载体系统.首先,将HSV-1内部反向重复序列(internal inverted repeat sequences,IR)两侧的片段克隆入p KO5获得穿梭质粒p KO5/BN,其电转含p HSVBAC的大肠杆菌后筛选获得删除IR区重组DNA的p HSVΔIR-BAC.p HSVΔIR-BAC转染Vero细胞获得删除IR区的重组病毒HSVΔIR(MH1001).上述p KO5/BN和含p HSVΔIR-BAC的大肠杆菌构成了HSV-1载体系统.利用该系统获得了表达绿色荧光蛋白EGFP的重组病毒HSVΔIR/EGFP(MH1002).MH1001和MH1002在感染的Vero细胞中增殖水平略低于野生型HSV-1,但无显著差异;Western印迹检测表明,重组病毒早期蛋白质ICP0、ICP4、ICP8、ICP22、ICP27在感染细胞中的表达水平下降;免疫荧光及激光共聚焦检测表明,重组病毒与野生型病毒均存在于细胞质中.以上结果表明,删除IR区的重组HSV-1保留了复制能力,能够携载并表达外源基因,建立的HSV-1载体系统可用于构建携载外源基因的复制型重组HSV-1.