反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

反转录酶在微小RNA实时荧光定量聚合酶链反应中的作用

目的以微小RNA(miRNA)作为检测样本,考察影响实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测结果的关键点,并筛选出最优的检测方法。方法采用3种miRNA提取方法(分别使用EasyPure^(■)miRNA提取试剂盒、miRNA提取试剂盒、TransZol Up Plus RNA提取试剂盒)和3种反转录方法(分别使用TransScript^(■)第一链cDNA反转录试剂盒、Evo M-MLV反转录试剂盒、miRNA第一链cDNA合成试剂盒)处理大鼠纹状体脑区,检测miRNA与c DNA的质量和效率,并使用常规RT-qPCR检测miRNA水平,比较不同方法所得结果。结果3种RNA提取方法得到的miRNA质量和效率比较差异均有统计学意义,其中方法2的效果较好,但方法1、2、3的RT-qPCR结果比较差异无统计学意义(miR-132:25.91±9.79、25.26±10.25、27.28±7.39,miR-U6:27.98±11.25、25.98±9.78、29.62±9.65,均P>0.05);3种反转录方法所得实验结果比较差异有统计学意义,方法3所得结果明显低于方法1、方法2(miR-132:16.53±3.17比35.20±1.06、31.42±2.95,miR-U6:16.63±1.73比36.06±2.57、35.59±1.54,均P<0.05),主要影响RT-qPCR的扩增效率和扩增特异性。结论使用能高效富集约18 nt大小RNA的提取方法和在miRNA的3’末端加多聚A尾(Poly A)的反转录酶,可以得到更可靠的RT-qPCR结果。

聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒(英文)

为了建立检测猪内源性反转录病毒 (porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法 ,根据已发表的 PERV的序列 ,设计并合成了针对 PERV核心蛋白 (gag)、多聚酶 (pol)、囊膜蛋白 (env)基因的 3对引物 ,预期扩增片段分别为 36 1、15 0、2 6 5 bp。应用 PCR技术检测了 PERV在 4株猪源细胞中的整合情况。结果表明 ,在所有被检细胞的基因组中均存在有 PERV的前病毒序列 ;应用 RT- PCR检测上述 4株猪源细胞中 PERV特异性 m RNA的表达 ,结果均为阳性。试验还对建立的上述 2种方法的特异性进行了探讨 ,结果表明试验建立的 PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究 PERV奠定了基础 ,还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。

实时定量反转录聚合酶链反应检测患儿急性粒细胞性白血病1-ETO融合基因的临床意义

目的分析实时定量RT-PCR在检测急性粒细胞性白血病（AML）1-ETO融合基因阳性AML微小残留病中的临床意义。方法对2000年1月-2007年1月收治的32例AML1-ETO阳性AML患儿进行实时定量RT-PCR检测。诱导化疗结束后及在巩固化疗阶段每1.5-2.0个月行AML1-ETO融合基因定量检测。使用Kaplan-Meier法分析不同融合基因水平患儿生存率。采用SPSS10.0软件进行统计学分析。结果共32例患儿进行诱导化疗,其中29例（90.625%）达到形态学完全缓解,3例形态学未缓解后放弃。达到分子生物学缓解患儿有更高的无瘤生存率（P=0.0018）。AML1-ETO高拷贝数组生存率低于低拷贝数组（P=0.1080）。诱导缓解化疗结束后AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率低于定量〈10^-3组生存率（P=0.0230）。化疗6个月时AML1-ETO定量结果示〉10^-3组生存率高于定量〈10^-3组生存率（P=0.0001）。巩固化疗结束时AML1-ETO定量〉10^-5组生存率低于定量〈10^-5组生存率（P=0.0049）。结论定量评估AML1-ETO阳性的小儿AML微小残留病十分重要,有可能对治疗方案的选择提供重要信息。

人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的竞争性逆转录-聚合酶链反应定量分析

为建立人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达检测方法 ,研究载脂蛋白E基因与儿童健康的关系 ,我们抽取 2 6例健康儿童外周静脉血 ,分离血单核细胞 ,抽提RNA ,采用逆转录—聚合酶链式反应检测载脂蛋白E基因表达 ,并以正常人cDNA作定量标准物 ,待测样品与定量标准物共扩增 ,计算出待测样本的个体的mRNA量。研究发现载脂蛋白E基因能在健康儿童周围血单核细胞表达 ,健康儿童载脂蛋白E基因表达量为 0 .37± 0 .15mol/molmRNA。表明采用竞争性逆转录—聚合酶链反应方法来检测人周围血单核细胞载脂蛋白E基因表达的分析方法快速、简便、灵敏、实用、可靠 ,且能准确定量 ,值得推广应用。

竞争性逆转录-聚合酶链反应对哮喘患者诱导痰白细胞介素-10基因表达的定量分析

目的:建立竞争性逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)定量方法,监测哮喘患者白细胞介素-10(IL-10)基因的表达水平,探讨IL-10在哮喘气道炎症中的作用和临床意义。方法:用酶切法构建IL-10内标分子,用已知量的该内标分子,通过竞争性RT-PCR对哮喘组(30例)和对照组(29例)的诱导痰和外周血IL-10 mRNA进行定量分析。结果:哮喘发作期患者的诱导痰和外周血绝大多数未检测到IL-10 mRNA,部分缓解期患者有少量IL-10 mRNA表达。健康对照者外周血和诱导痰均有IL-10 mRNA表达。结论:哮喘患者的气道炎症过程与IL-10基因表达有关,且存在IL-10转录水平的合成障碍。

反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2 mRNA

目的:建立反转录聚合酶链式反应定量分析巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)mRNA的方法。方法:以β-肌动蛋白(β-actin)为内参照,通过优化RT-PCR条件定量MIP-2 mRNA的表达。结果:获取了PCR线性扩增范围,确定了RT-PCR的最佳循环次数和模板量。结论:优化的RT-PCR方法可以用于MIP-2 mRNA的分析。

反转录聚合酶链反应检测自身免疫疾病和正常人外周血淋巴细胞C-myc癌基因的表达

目的：探讨癌基因Ｃ－ｍｙｃ在自身免疫病患者和正常人外周血淋巴细胞上的表达情况。方法：分离正常人及系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）、类风湿性关节炎（ＲＡ）患者外周血淋巴细胞，采用异硫氰酸胍一步法提取ＲＮＡ，利用反转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，比较正常人及自身免疫病患者外周血淋巴细胞Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达程度。结果：ＳＬＥ患者外周血淋巴细胞Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达较正常人和ＲＡ患者高，ＲＡ和正常人之间没有差异。ＨＬ－６０细胞系Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ表达最强，ＧＢＣ胃癌细胞株较正常人为高。结论：提示Ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ在肿瘤细胞株及ＳＬＥ患者外周血淋巴细胞上有较高的表达，认为自身免疫病原癌基因的表达在其发病机理中具有重要的作用。

实时定量反转录-聚合酶链反应检测机械力对人牙周膜细胞骨钙素表达的影响

目的观察周期性牵张力作用下人牙周膜细胞(HPDLCs)成骨分化关键基因骨钙素的表达变化,以明确周期性牵张力对HPDLCs成骨分化的诱导作用。方法利用自行研制的多通道细胞牵张应力加载系统对体外培养的HPDLCs施加12%形变率、0.1Hz周期性牵张力1,2,3,5d,实时定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测其成骨分化基因骨钙素(BGLAP)表达的时序性变化。结果体外培养HPDLCs骨钙素基因表达量极低,加力1、2、3、5d后骨钙素基因表达依次升高,并且在加力5d时表达量明显增高为对照组的71.6倍。结论周期性牵张力可以诱导HPDLCs向成骨方向分化,骨钙素在机械力诱导成骨分化的后期发挥作用。

应用逆转录─聚合酶链反应检测碱性成纤维细胞生长因子基因表达的研究

目的：研究内源性碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在周围神经损伤后的表达变化规律。探讨bFGF促周围神经再生的机制。方法：Wistar大鼠102只，体重150－200克，随机分为实验组、对照组和正常组，实验组暴露坐骨神经后在坐骨切迹下1cm处用改良持针器压至第3格，持续5分钟，造成SunderlandⅡ型损伤，对照组动物只切开皮肤暴露坐骨神经，在相应部位标记后缝合，正常组动物不做任何特殊处理。分别于术后4小时、1、3、7、14、21、28天处死大鼠取材，分别切取挤压伤部位、腰4－6背根节及相应脊髓节段标本，应用逆转录──聚合酶链反应（revers－poly－merasechainreaction，RT－PCT）并结合2％琼脂凝胶电泳、7％非变性聚丙烯酰胶凝胶电泳，通过凝脉成像分析系统对bFGFmRNA的表达进行定量分析。结果：实验组从伤后4小时开始，bFGFmRNA在损伤局部，腰4－6背根节及相应脊髓节段的表达开始增强，与对照及正确组比较有显著差异（P＜0'05），大约在伤后7天在上述部位的表达水平最高，伤后28天又降至正常及对照组水平（P＞0．05）。2％琼脂糖电泳在伤后4小时及28天左右的损伤局部及背报节标本，未检测出bFGFm-RNA的表达。结论：周围神经损伤后内源性bFGFmRNA在损伤局部，腰4－6背报节及相应脊髓节段有增强表达趋势；?

CK19 mRNA逆转录聚合酶链反应检测循环乳腺癌细胞

目的评估细胞角质蛋白CK19mRNA检测对乳腺癌诊断的应用价值。方法Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌患者各77例,40例非肿瘤志愿者。每例取1.5ml外周静脉血,小量血总RNA快速抽提纯化,RT PCR扩增产物作琼脂糖凝胶电泳并测序,对比其在不同分期乳腺癌中的阳性率。结果琼脂糖凝胶电泳和测序证实扩增产物为目的片段。Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌患者外周血CK19mRNA阳性率分别为19.48%(15/77)和40.26%(31/77),显著高于正常对照的5%(2/40)(P=0.037,P=0.001),且Ⅲ/Ⅳ期乳腺癌患者外周血CK19mRNA阳性率显著高于Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌患者(P=0.005)。结论CK19RT PCR是检测乳腺癌循环肿瘤细胞的较好方法,对治疗决策可能有指导意义。

实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的比较

目的比较实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法与细胞培养法检测流行性感冒病毒的差异。方法采用实时荧光定量RT-PCR及经典的狗肾传代细胞病毒分离2种方法 ,同时对流感监测点送检的80份疑似流感标本检测流感病毒。结果细胞培养病毒分离的阳性数为26份,实时荧光定量RT-PCR的阳性数为36份,好=8.1,P<0.005。结论 通过该实验,验证了实时荧光定量RT-PCR的确快速敏感,适用于实验室快速诊断。

犬瘟热病毒反转录-聚合酶链反应诊断方法的建立和初步应用

根据Ｂａｒｅｔ报道的犬瘟热病毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ弱毒株的融合蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增３２４ｂｐ基因片段的引物。将异硫氰酸胍－酚－仿一步法提取得到的细胞总ＲＮＡ进行反转录，以此产物为模板进行ＰＣＲ扩增，并对ＰＣＲ扩增条件进行了优化。经鉴定，以此对引物进行的ＰＣＲ扩增，得到了与设计片段大小和酶切位点相同的产物，且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三种病原的核酸，这表明此方法为特异性的。对２７条（只）临床病例和３２份细胞培养物进行检查，并与电子显微镜负染检查结果进行了比较。初步应用研究的结果表明，此方法可用于犬瘟热病毒的临床诊断和实验研究。

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒

用逆转录—聚合酶链反应检测马铃薯卷叶病毒张彤，哈斯阿古拉，张鹤龄，刘莉（内蒙古大学生物工程中心，呼和浩特，０１００２１）关键词卷叶病毒，反转录－ＰＣＲ，诊断马铃薯卷叶病毒（Ｐｏｔａｔｏｌｅａｆｒｏｌｌｖｉｎｉｓ，ＰＬＲＶ）属黄化病毒组（Ｌｕｔｅｏｖｉ...

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒

应用反转录聚合酶链式反应快速检测蕃茄环斑病毒陈京，胡伟贞，于嘉林，韩成贵关键词反转录聚合酶链式反应，蕃茄环斑病毒近年来发展起来的分子生物学新技术一聚合酶链式反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）已在检测和分子生物学研究等许多领...

逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术同时检测水中多种肠道病毒

建立了一种利用通用引物RT-PCR技术检测水中肠道病毒的方法.利用脊髓灰质炎病毒1～3型,柯萨奇病毒B3型作为参考病毒株,根据肠道病毒RNA5′非编码区中具有高度同源性的序列来设计通用引物.比较了M-MLV酶和AMV酶的逆转录效果,AMV酶能够成功地从地表水和生活污水中逆转录病毒RNA,更适于实际应用.对比研究了PCR过程中的退火温度,c(Mg2+)等因素对RT-PCR检测结果的影响,选择退火温度55℃,c(Mg2+)为2 mmol/L的反应条件,优化了RT-PCR检测方法.通过检测水样中接种的连续稀释的病毒,确定了该检测方法的灵敏度为38 CCID50.考察人工污染的地表水、污水、二级处理出水样品发现,检测灵敏度基本一致.该方法可应用在实际环境的肠道病毒检测中.

逆转录聚合酶链反应检测结直肠癌淋巴结微转移的临床意义

背景与目的:结直肠癌淋巴结微转移灶是否有预测预后价值目前尚有争议,本文对结直肠癌患者淋巴结微转移情况进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测,研究微转移对临床分期和预后的影响。方法:用RT-PCR技术检测56例结直肠癌患者肠旁及系膜淋巴结中细胞角质蛋白CK20mRNA,揭示微转移灶的存在,并与常规病理苏木精伊红(HE)染色和免疫组化染色结果进行比较;分析HE染色和RT-PCR检测结果对判定临床病理分期和统计生存率的影响。结果:共检测432个淋巴结,HE染色、免疫组化染色和RT-PCR法淋巴结转移检出率分别为57.2%、62.3%和73.1%。HE染色和免疫组化的检出率无显著性差异(P>0.05),而HE染色和RT-PCR法检测结果有显著性差异(P<0.05)。56例患者中,按HE染色结果确定的PN0、PN1和PN2期,其5年无复发转移生存率分别为80%、60%和50%;通过RT-PCR技术检测,升级后的PN0、PN1和PN2期5年无复发转移生存率分别为100%、61.9%和55.6%,两种方法分析的结果有显著性差异(P<0.05)。结论:HE染色未确切指出淋巴结微转移癌;RT-PCR法检测CK20mRNA可以推断淋巴结微转移癌的存在,从而有助于确定结直肠癌临床分期和预测预后。

鉴别猪瘟强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法的建立

【目的】建立一种能区分猪瘟病毒(classicalswinefever,CSFV)强毒和弱毒的反转录-复合套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)检测方法。【方法】根据GenBank上登录的现有CSFV基因组全序列,选择高度保守区设计了一对CSFV通用引物,并在该对引物跨越区域的内部设计了猪瘟兔化弱毒疫苗和强毒特异性引物,建立了一种能区分猪瘟强毒和弱毒的RT-nPCR鉴别诊断方法。【结果】应用该方法从猪瘟兔化弱毒疫苗和石门强毒株基因组中扩增出了大小分别为447和343bp的一条特异性片段,从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为447和343bp的两条特异性片段,但对牛病毒性腹泻病毒和其它常见猪源病毒细胞培养物以及正常细胞基因组进行检测时均为阴性。该方法可以检测出0.04pg的CSFVRNA。对从黑龙江省采集的15份疑似猪瘟病料进行了检测,结果表明,有14份类似猪瘟强毒,1份类似弱毒疫苗。限制性片段长度多态性和种系发生分析证实了RT-nPCR的检测结果。【结论】本研究建立的RT-nPCR可以有效区分猪瘟强毒和弱毒,减少了未感染的免疫猪被误杀的可能性。

用反转录─聚合酶链反应快速鉴别新城疫病毒

根据新城疫病毒基因结构特点及强、弱毒株Ｆ０ 裂解位点的序列差异设计２ 对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别诊断新城疫强、弱毒株的反转录聚合酶链反应（ ＲＴＰＣＲ） 技术。试验表明，该方法具有快速特异和操作简便等特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，也适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。