Ph^+/bcr-abl^+急性淋巴细胞白血病微小残留病变的细胞遗传学分析、巢式RT-PCR及流式细胞术检测

为了探索检测Ph+ /bcr abl+ 急性淋巴细胞白血病 (ALL)患者的微小残留病变 (MRD)的简便而灵敏的方法 ,对 84例初治ALL患者和其中的缓解期患者的骨髓分别用细胞遗传学、流式细胞术和巢式RT PCR检测。结果表明 ,缓解期患者骨髓中不存在Ph′染色体 ,巢式RT PCR方法检测到 11/ 14例缓解期患者存在MRD(bcr abl融合基因 ) (阳性率 78 5 7% ) ,而流式细胞术检测到 5 / 14的缓解期患者阳性 (阳性率 35 71% )。巢式PCR的灵敏度达到 10 -6- 10 -7水平 ,流式细胞检测的灵敏度达到 10 -4- 10 -5水平。结论 :Ph染色体核型分析技术检测MRD不够灵敏 ,而巢式RT PCR检测MRD较流式细胞技术检测灵敏度更高 ,且更易于开展应用。

单细胞巢式PCR检测RHD的初步研究

目的建立单细胞巢式PCR检测技术,用以检测单个细胞的RHD。方法采用稀释法获得单个细胞,直接提取DNA,根据RHD特点设计两对特异性引物进行巢式PCR,凝胶电泳观察结果,将扩增产物测序以检测扩增的目的基因。结果通过巢式PCR,阳性对照可以获得明显的目的产物,阴性和空白对照无扩增产物,10份Rh阳性单细胞检测标本均能检出RHD。结论建立的检测RHD单细胞巢式PCR检测技术具有很好的特异性和敏感性,可应用于生殖医学等领域,为预防Rh新生儿溶血病提供新的技术途径。

巢式RT-PCR检测乳腺癌外周血循环肿瘤细胞的临床价值

目的:联合采用细胞角蛋白19(cytokeratin 19,CK19)及乳腺上皮黏蛋白(small breast epithelial mucin,SBEM)指标,探讨通过巢式RT-PCR(nested RT-PCR)方法检测乳腺癌患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTC)的临床价值。方法:采用MCF-7RNA与健康志愿者外周血单核细胞(peripheral mononuclear cell,PMNC)RNA进行梯度混合后的反转录产物,检测优化后巢式RT-PCR体系的敏感性,再选择10例健康志愿者以及20例乳腺良性疾病患者外周血检测其特异性后,对56例乳腺癌患者外周血中CK19 mRNA及SBEM mRNA表达情况进行检测。结果:优化后的检测体系能够在3ml外周血PMNCs中检测到1个MCF-7细胞,10例健康志愿者以及20例乳腺良性疾病患者外周血中未检测到CK19 mRNA与SBEM mRNA的表达;两者的表达与原发肿瘤大小,腋窝淋巴结状况及TNM分期相关(P<0.05),而与原发肿瘤病理类型,激素受体以及C-erbB-2的表达无明显相关性(P>0.05)。结论:经过优化的巢式RT-PCR体系联合检测乳腺癌患者外周血CK19 mRNA及SBEM mRNA的表达敏感性和特异性较高,能用于检测外周血CTC,对进一步精确评估预后及指导治疗可能有较高的临床价值。

单细胞五重巢式PCR检测DMD基因

目的:探索建立单细胞多重巢式PCR检测杜氏肌营养不良症(DMD)基因外显子17、19、44、45、48的技术,及应用于植入前遗传学诊断(PGD)的前景。方法;获取正常男性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞,行DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR,分析扩增成功率、假阳性率和假阴性率。结果:20个单个淋巴细胞5个外显子扩增成功率为97％(97/100)、假阳性率为4％(1/25)、假阴性率为0％(0/25),20个单个胚胎细胞5个外显子扩增成功率为80％(80/100)、假阳性率为0％(0/25)。结论:本文建立的单细胞DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,应用于DMD的PGD具有现实的可能性。

半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究

菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）在美国东部和南部的大豆产区广泛分布。该病毒能够造成3％～52％的产量损失并使大豆品质降低，目前我国未见其分布。针对进口大豆种子的植物病毒检测，本文建立了半巢式RTPCR技术检测BPMV的方法。该方法采用Trizol快速提取大豆种子病毒总RNA，并根据BPMV的外壳蛋白编码基因设计特异性引物，经第一轮RT—PCR和第二轮半巢式PCR扩增．分别得到275bp和196bp大小的特异性基因片段。半巢式RT—PCR扩增产物的测序表明，该产物序列与BPMV的外壳蛋白编码基因存在91％～95％的高度同源性。检测灵敏度比较研究显示，DAS—ELISA与RT—PCR的检测灵敏度相近，半巢式RT—PCR的检测灵敏度比这2种方法高出10^3倍以上。

激光捕获显微切割-单细胞PCR技术的应用研究

目的建立一套优化的激光捕获显微切割一单细胞聚合酶链反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术，应用于分子组织学研究中单细胞基因的检测。方法从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中，应用激光捕获显微切割获取1～10个淋巴细胞，采用优化的单细胞PCR反应体系和条件进行β-珠蛋白基因检测。结果单轮常规PCR各组多细胞的扩增阳性率比较无显著性差异（P〉0．05），而单细胞的扩增阳性率低于各组多细胞，有显著性差异（P〈0．01）；半巢式降落式PCR的单细胞扩增阳性率高于单轮常规PCR，有显著性差异（P〈0．01）。结论联合应用优化的激光捕获显微切割及半巢式降落式PCR技术，显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性。

尼帕病毒巢式RT-PCR方法的建立和初步应用

目的建立灵敏、特异的检测尼帕病毒的巢式RT-PCR方法。方法根据GenBank公布的尼帕病毒N基因序列,设计2对特异性引物(外引物和内引物),建立巢式RT-PCR方法,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行临床样品的检测。结果该方法扩增的片段序列与源序列同源性均为100%。特异性试验结果表明本试验设计的内外侧引物不能从新城疫病毒、牛瘟病毒和日本乙型脑炎病毒中扩增出条带。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测出的标准模板RNA浓度为39fg/μL。100份临床样品检测结果全部为阴性。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测尼帕病毒N基因的巢式RT-PCR方法,可用于动物疫病监测和检验检疫等领域。

番茄环斑病毒的普通RT-PCR和巢式PCR检测方法

根据番茄环斑病毒(ToRSV)外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计了2对引物(引物对I和II),利用RT-PCR分别扩增出预期大小的800bp和580bp的条带,其中引物对II扩增效率较高、特异性较好。以引物对I和II进行2轮PCR扩增,建立了巢式PCR检测方法,其灵敏度比普通RT-PCR提高100～200倍。序列测定和分析表明所测定的序列为ToRSVCP基因的部分序列,在系统关系树上与ToRSV的其他分离物形成一簇,亲缘关系很近。

巢式RT-PCR扩增MMP-7诊断大肠癌淋巴结的微转移

目的:建立巢式逆转录聚合酶链式反应(nestedreversetranscriptase-polymerasechainreaction,nestedRT-PCR)扩增MMP-7mRNA,检测大肠癌淋巴结微转移.方法:据MMP-7基因序列设计两对引物,建立巢式RT-PCR扩增体系,检测MMP-7mRNA在30例行根治性手术大肠癌患者187个淋巴结中及10例良性肠道疾病患者25个淋巴结中的表达,并与传统组织学检查相比较.结果:大肠癌患者30例187个淋巴结中97个MMP-7mRNA表达,阳性率51·87%(97/187),病理学检查仅57个淋巴结有肿瘤转移;10例良性肠道疾病25个淋巴结扩增结果阴性.结论:巢式逆转录聚合酶链式反应检测淋巴结MMP-7mRNA的表达是诊断大肠癌微细胞转移灵敏的指标,其结果较常规病理组织学检查敏感,可对精确大肠癌的临床分期、判断患者预后及治疗提供一定理论依据.

模板制备方法对单细胞PCR检测DMD基因的影响

旨在探讨模板制备方法对单细胞 PCR准确性的影响 ,采用 KOH/ DTT和液氮冻融煮沸两种不同方法裂解单个淋巴细胞 ,行 DMD基因外显子 17、19、4 4、4 5、4 8五重巢式 PCR.用 KOH/DTT法裂解的细胞扩增成功率为 98% ( 147/ 150 ) ,失败率为 2 % ( 3/ 150 ) ;用液氮冻融煮沸法裂解的细胞扩增成功率为 78% ( 117/ 150 ) ,失败率为 2 2 % ( 33/ 150 ) ,差异有显著性 (χ2 =2 8.4 ,P <0 .0 1) .结果表明单细胞 PCR模板制备与 PCR扩增失败有密切关系 ,选用合适的细胞裂解方法可提高单细胞

应用巢式PCR法检测猪单个胚胎中的基因突变

单胚胎基因突变检测技术是以单个胚胎的裂解产物为模板进行DNA或RNA分析的方法,该技术的建立将为在单细胞水平进行基因表达和突变检测提供简便而快捷的方法。本研究设计了2对巢式引物,以显微注射了Cas9mRNA和猪SS基因2个靶点的gRNA的四细胞期孤雌胚胎为试验材料,通过蛋白酶K对猪单个胚胎进行裂解后直接进行巢式PCR分型,并检测到猪胚胎中SS基因的删除突变。该方法可以最大限度减少假阴性和假阳性结果的出现,在猪基因突变检测中具有重要作用。

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义。

单细胞巢式PCR诊断软骨发育不全

目的 探讨单细胞水平诊断软骨发育不全 ( achondroplasia,ACH)的可靠性 ,为开展 ACH的胚胎植入前遗传学诊断 ( preimplantation genetic diagnosis,PGD)打下基础。方法 采用巢式 PCR扩增单淋巴细胞及单卵裂球的成纤维细胞生长因子受体 3基因的高发突变位点 G380 R区域 ,用限制酶 Bfm 消化 PCR产物 ,10 %聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。结果 单淋巴细胞的 PCR扩增成功率为 90 .4 % ,等位基因脱扣发生率为 8.2 % ,诊断准确率为 91.8% ;单卵裂球的扩增成功率为 75 .4 %。结论 单细胞巢式 PCR诊断 ACH是比较稳定。

应用巢式PCR对单细胞进行性别诊断的初步研究

目的 应用巢式 PCR技术对人类植入前胚胎进行性别诊断。方法 收集单个或两个淋巴细胞和卵裂球 (5 0个 /组 ) ,按不同的方法处理单细胞 (纯水法、冻融法、碱法 ) ,而后行巢式 PCR扩增牙釉质基因。结果 纯水法、冻融法、碱法处理后 ,扩增率分别为 83%、94 %、95 %。后两种处理方法的扩增效率明显高于纯水法 (P<0 .0 1) ,通过检测正常男性单淋巴细胞基因型发现 3种方法等位基因脱失率分别为 2 4 %、12 %、4 % ,差异有显著性 (P<0 .0 5 )。两个淋巴细胞或卵裂球的扩增率及等位基因脱失率与单细胞相比差异无显著性。结论 提高植入前遗传学诊断的准确性主要取决于如何克服单细胞 PCR的缺点 ,采用碱法裂解单细胞及取两个卵裂球进行检测可提高用于性别诊断的单细胞

单细胞双重巢式PCR扩增X、Y染色体STS、AMEL同源序列行性连锁遗传病诊断

目的在单细胞水平建立一种简便、快速、高准确性的胎儿性连锁遗传疾病诊断方法，为无创性产前诊断性连锁遗传病和植入前遗传学诊断提供一定的理论与方法学依据。方法提取男女单个淋巴细胞各150例，共300个细胞。随机分成3组，每组男女细胞各50个，双重巢式PCR技术在单细胞水平同时扩增X-类固醇硫酸脂酶基因（steroid sulfatase gene，STS）／Y-假基因和牙釉质基因（amelogenin gene，AMEL），对照组用单重巢式PCR技术在单细胞水平分别扩增两基因，比较单、双重巢式PCR技术在单细胞水平的扩增率及性别诊断正确率。结果单重巢式PCR扩增男性细胞STS和AMEL的扩增率和性别诊断正确率分别是84％、76％和84％、84％；而双重巢式PCR技术同时扩增上述基因的扩增率和性别诊断正确率分别为98％、96％。后者与前两者相比扩增率和性别诊断正确率均明显提高，差异均有统计学意义（P〈0．05，P〈0．01）。结论在单细胞水平性连锁遗传疾病诊断中，双重巢式PCR技术较单重巢式PCR技术具有较高的扩增率及正确率，并有助于发现等位基因脱扣。该法在无创性单基因伴性遗传病的产前诊断和植入前遗传学诊断中具有较高的实际应用价值。

沙培林抑制胃癌细胞腹腔内微转移的研究

目的研究沙培林对胃癌细胞腹腔内微转移的预防和治疗作用。方法手术前48小时向随机选择的24例进展期胃癌患者腹腔内注射沙培林5KE,37例进展期胃癌患者腹腔内注射生理盐水20ml,手术中收集腹腔冲洗液,用巢式RT-PCR法测定腹腔冲洗液中CEAmRNA的表达。结果实验组24例中有4例(20.8%)CEAmRNA表达阳性,对照组37例中,有16例(43.2%)CEAmRNA表达阳性。两组间有差异有统计学意义(P<0.01)。结论胃癌患者腹腔内注射沙培林CEAmRNA阳性表达率降低。

五重巢式PCR同步检测单细胞杜氏肌营养不良基因和性别的研究

目的 建立五重巢式PCR技术同步检测单细胞DMD基因和性别 ,探讨该技术在杜氏肌营养不良症的植入前诊断 (DMD -PGD)的可行性。方法 获取正常男性、女性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞 ,用五重巢式PCR技术检测DMD基因外显子 17、19、44、48和SRY基因。结果 在正常男性单个淋巴细胞扩增成功率为 96 7% (145 /15 0 ) ,假阳性率为 4% (1/2 5 ) ,假阴性率为 0 (0 /2 5 )。在正常女性单个淋巴细胞扩增成功率为 98% (147/15 0 ) ,假阳性率为 0 (0 /2 5 ) ,假阴性率为 0 (0 /2 5 )。 15个胚胎细胞扩增成功率为 10 0 % (6 6 /75 ) ,假阳性率为 0 (0 /2 5 )。结论 本文建立的单细胞DMD基因外显子 17、19、44、48和SRY基因五重巢式PCR技术具有较高的敏感性和特异性 ,有望应用于DMD

检测MUC-1 mRNA对诊断非小细胞肺癌患者外周血微转移的意义

背景与目的:粘蛋白家族,包括MUC-1,通常被认为是上皮组织及其来源的肿瘤的产物,理论上如果在间叶组织来源的血液中找到MUC-1 mRNA即意味着癌转移。本研究探讨MUC-1 mRNA作为分子指标检测非小细胞肺癌患者外周血微转移的可行性。方法:应用巢式RT-PCR技术检测60例非小细胞肺癌患者外周血中MUC-1基因的表达,并以15例肺良性疾病患者及20名健康人外周血作为对照,同时使用相同的方法,扩增非上皮细胞来源的细胞株K562,HL-60及上皮细胞来源的细胞株A549、MCF-7,以观察靶基因的表达情况。结果:病患组MUC-1 mRNA表达阳性率达80.0%(48/60),15例肺良性疾病患者及20例健康人外周血中MUC-1 mRNA表达阳性率分别为60.0%(9/15),65.0%(13/20),K562、HL-60及A549、MCF-7细胞株经巢式RT-PCR也可以扩增出靶基因的条带。结论:MUC-1 mRNA不是检测非小细胞肺癌外周血微转移的可靠指标。

非小细胞肺癌患者外周血中CK19 mRNA、MUC-1 mRNA及LUNX mRNA的表达及意义

目的应用巢式逆转录聚合酶链反应(Nested RT-PCR)技术检测非小细胞肺癌患者外周血中CK19mRNA、MUC-1mRNA及LUNXmRNA的表达,探讨其作为肺癌微转移检测分子标记物的可能性。方法应用巢式RT-PCR技术检测60例非小细胞肺癌患者外周血中靶基因的表达,并以15例肺良性疾病及20例健康人外周血作为对照。结果CK19mRNA、MUC-1mRNA及LUNXmR-NA表达的阳性率为:51.7%(31/60)、80.0%(48/60)和55.0%(33/60)。对照组中15例肺良性疾病及20例健康人外周血中无LUNXmRNA表达,20例健康人外周血中有1例CK19mRNA表达,而MUC-1mRNA表达的阳性率在肺良性疾病中为60.0%(9/15),在健康人外周血中为65.0%(13/20)。结论CK19mRNA、LUNXmRNA作为检测非小细胞肺癌患者外周血微转移的分子标记物,具有良好的敏感性和特异性,而MUC-1mRNA作为诊断非小细胞肺癌微转移的指标还需进一步探讨。

巢氏PCR扩增强直性肌营养不良基因在植入前诊断中的局限性

目的 Ⅰ型强直性肌营养不良（myotonic dystrophy 1，DM1）是由于肌强直蛋白激酶基因（DMPK）3′端非翻译区的（CTG）。异常扩增导致。探讨用巢氏PCR法直接扩增该基因在植入前诊断的可行性。方法0．5％低熔点琼脂糖分离来自DMPK（CTG）100的DM1患者的单个精子，巢氏PCR法扩增DMPK基因。结果106例精子标本中53例扩增产物电泳为单条带，但48例产物显示为多条带，扩增产物长度介于（CTG）10至（CTG）30之间。结论利用低熔点琼脂糖可有效分离单个精子进行检查，而巢氏PCR在单细胞水平上直接扩增较多（CTG）n的DMPK基因时存在困难，应用于植入前诊断时容易造成误诊。