应用单细胞cDNA扩增技术鉴定循环肿瘤细胞

目的建立单细胞cDNA扩增技术,实现在分子水平鉴定循环肿瘤细胞。方法建立结肠癌循环肿瘤细胞模型,通过免疫荧光染色和显微切割技术分离出单个血细胞和肿瘤细胞;裂解细胞后利用碱基修饰的P1(dT)_(24)引物反转录出cDNA第一链,并给第一链cDNA加上PolyA尾后利用碱基修饰的P2(dT)_(24)引物合成第二链cDNA,然后利用P1(dT)_(24)和P2(dT)_(24)引物扩增分别得到血细胞和肿瘤细胞的全长cDNA;最后通过PCR检测细胞特异的标记物CD45、EpCAM和CK19。结果改良后的单细胞cDNA扩增方法能够获得高质量的全长cDNA,并能显著增加PCR检测效率;利用扩增得到的cDNA通过PCR检测细胞表面标记物CD45、EpCA M和CK19的表达,能有效鉴定出外周血中混杂的肿瘤细胞。结论通过单细胞cDNA扩增技术在基因水平识别肿瘤细胞,建立了一种新的循环肿瘤细胞的鉴定方法。

单细胞全基因组扩增技术与应用

同一组织中的细胞往往具有类似的结构和功能,然而通过对单个细胞进行测序分析后,发现每个细胞都具有一定异质性.单细胞全基因组扩增技术是进行单细胞测序的前提,该技术可用于揭示单细胞基因组结构差异,同时在肿瘤研究、发育生物学、微生物学等研究中发挥重要作用,并成为生命科学研究技术的热点之一.单细胞全基因组扩增技术的难点在于单细胞的分离和全基因组的扩增.本文介绍了单细胞全基因组扩增技术中常用的单细胞分离技术和单细胞全基因组扩增技术,并对各技术间的优缺点进行比较,同时着重讨论该技术在肿瘤研究、发育生物学和微生物学研究中的应用.

低体积PCR扩增用于单细胞分离和检验

目的优化在单细胞分离检验中应用0.2mL试管做低体积扩增载体的最佳反应条件。方法制备理想口腔上皮细胞悬液,用0.2mL试管分别收集捕获到的5、10个细胞,设置蛋白酶K添加、PCR反应金牌酶用量、循环次数3组条件,用Identifiler誖Plus试剂盒进行复合扩增,比较各组的检出率、等位基因丢失率和非特异性扩增情况。结果用0.2mL试管做低体积扩增中,加蛋白酶K裂解、PCR反应金牌酶0.4μL、PCR反应32个循环,这3个条件的检出率较高,等位基因丢失率较低。结论在单细胞分离检验中采用0.2 mL试管进行低体积扩增,可以作为芯片-低体积扩增的有效补充手段。

cDNA末端快速扩增技术的研究进展

cDNA末端快速扩增技术是一种基于多聚酶链式反应的技术 ,它的发展大大便利了应用其它方法获得的部分cDNA序列后克隆全长cDNA 5’和 3’末端的工作。不仅RACE方法能在短时间内得到完整的cDNA末端序列 ,而且一些截短的cDNA末端常常也能在RACE的过程中被扩增 ,而这些截短的产物破坏了全长cDNA克隆的获取。许多研究者对RACE的流程提出了改进方案 ,从而提高了该技术的效力。本文介绍了许多已发表的RACE技术关键步骤的改良 ,包括一些具体有效的操作流程 ,如RNA连接酶介导的RACE/连接锚定PCR等 ,还有其有效性的例证。

新型单细胞扩增技术有助避免遗传病

中美研究人员在新一期美国《科学》杂志上报告说,他们研制出一种新型单细胞全基因组扩增技术,在此基础上不仅有望避免许多遗传性疾病遗传给后代,从基因组角度更深入地认识癌症也将成为可能.单细胞研究是当前生命科学研究的重要方向之一.许多关键的生命活动都和细胞间个体差异密切相关;许多重要的生命科学和医学问题所能依赖的样品往往也是极少数细胞.

应用荧光PCR技术检测单细胞β地中海贫血基因

【目的】应用荧光PCR技术检测单细胞β地中海贫血(β地贫)基因,并与巢式PCR相比较,探讨荧光PCR应用于β地贫植入前诊断中的可行性。【方法】获取β地贫41-42突变杂合子单个淋巴细胞,用巢式PCR及荧光PCR技术检测β珠蛋白基因。【结果】160个淋巴细胞进行荧光PCR扩增,β地贫基因的平均扩增效率为92.5%,等位基因脱扣(ADO)率为8.8%;240个淋巴细胞进行巢式PCR扩增,β地贫基因的扩增效率为91.7%,ADO率为15.8%。两种方法的扩增效率没有统计学差异,但荧光PCR的ADO发生率显著低于巢式PCR的ADO发生率(P<0.05)。【结论】本研究建立的单细胞荧光PCR技术具有较高的扩增效率,可显著降低ADO发生率,可望用于β地贫的临床植入前诊断。

3种碱性染液对显微捕获联合低体积扩增技术的影响

目的:比较3种碱性染液对显微捕获联合低体积扩增(Lowvolume polymerase chain reaction,LVPCR)技术的影响,为细胞分离检验中细胞核标记物的选择提供依据。方法:显微捕获联合LVPCR中,用苏木素、龙胆紫、亚甲基蓝3种染液对口腔上皮细胞进行标识。参照龙胆紫染色法,比较0.5、1、2、5、8μl苏木素染液及2、5、8、10、15μl亚甲基蓝染液的染色效果,优化染色条件;并比较优化后的细胞核标识效果。显微操作仪捕获3种染液染色后的细胞进行DNA检验,比较检测结果;并捕获染色10、30、60 min口腔上皮细胞,比较染色时间对DNA检测结果的影响。结果:100μl口腔上皮细胞悬液加入2μl苏木素、0.5μl龙胆紫或5μl亚甲基蓝染液,细胞核均着色明显,与胞浆对比清晰。5个细胞的分离检验结果示有效分型率分别为90%、100%、66.7%,成功分型率为20%、100%、11.1%;龙胆紫、苏木素染色时间(≤60 min)对DNA检测结果无明显影响,而亚甲基蓝染色时间延长导致等位基因丢失等现象加重,影响检测结果。结论:3种染液均可清晰标识细胞核;而龙胆紫染液对LVPCR技术抑制最弱,为三者中较优的细胞核标记物。

单细胞测序技术研究进展概述

单细胞测序技术是指在单个细胞的水平上对基因组进行高通量测序分析的技术,主要包括单细胞分离、细胞溶解与基因组DNA的获取、全基因组扩增及测序与数据分析四个方面的技术操作。本文概述单细胞测序技术的研究进展。

基于cDNA末端快速扩增的刚地弓形虫核仁G蛋白-1的克隆

目的 克隆弓形虫核仁G蛋白- 1(NOG1)基因的全长cDNA序列。方法 根据NCBIGeneBank中登录的弓形虫NOG1基因的唯一EST序列设计引物,利用cDNA 5’-末端快速扩增法(5’-RACE)和cDNA 3’-末端快速扩增法(3’-RACE)分别对已知序列进行延伸,将扩增获得的3’-端和5’-端未知序列与位于中间位置的已知序列进行拼接,然后经Blast检验全长序列的正确性。结果 5’-RACE扩增获得3个不同长度的片断,最长片断全长12 87bp ,去除引物和夹杂的已知序列后,通过5’-RACE在5’端扩增获得未知序列为1196bp。3’-RACE扩增后得到一条特异性条带,位于大约1.7kb左右,测序全长为16 34bp ,去除引物和已知序列,经3’-RACE扩增获得的3’-端未知序列为12 0 4bp。Blast全长为316 7bp的3段拼接序列,发现其覆盖NOG1基因cDNA的完整ORF或者CDS序列(6 5 0bp 2 80 9bp)。推导翻译出的蛋白质一级结构包含719个氨基酸(aa) ,在所有已发现物种的NOG1中,弓形虫NOG1基因的cDNA和相应的aa序列都是最长的。该序列已登录NCBIGeneBank ,核酸序列登录号AY6 86 734,对应蛋白质的aa序列登录号为AAT94 2 90。结论 本研究首次克隆获得了弓形虫NOG1基因的全长cDNA序列,并对相应的aa序列进行了推导翻译和简单分析。

单细胞PCR技术的研究进展

快速、准确、敏感和可靠的单细胞PCR技术是开展法医学、古微生物学、种植前遗传学诊断 (PGD)等的前提。综述一些常用的单细胞PCR策略 ,并对这些技术的研究进展作一些介绍。

鼻咽癌组织的显微切割及其RNA线性扩增

从微小体积鼻咽癌活检标本中获取纯净癌细胞一直是鼻咽癌分子生物学研究中的难题.为了寻找一种能从鼻咽癌活检组织中获得高纯度、高质量RNA来完成cDNA微阵列(cDNA Microarray)实验的简便实用方法,采用RNAlater技术保存鼻咽癌活检组织,显微切割技术来获得高纯度鼻咽癌细胞,利用RNA线性扩增技术得到cDNA微阵列实验所需RNA.结果表明:利用RNAlater技术可以很好地保持组织RNA的稳定,通过优化显微切割和RNA线性扩增的条件获得了cDNA微阵列实验所需的高纯度、高质量RNA.

应用抑制性消减杂交技术筛选三氧化二砷对肝细胞调节的差异表达基因

目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建As2O3处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆As2O3调节相关基因,阐明As2O3对肝细胞调节作用的分子生物学机制. 方法:以As2O3处理HepG2细胞,同时以PBS处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA 消减文库,并转染大肠杆菌J109进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建三As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到109个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到200-1000bp插入片段.挑取含有插入片段的36个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得15种已知基因序列和6个未知功能的新基因. 结论:应用SSH技术成功构建了As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.

RACE技术及其在寄生虫全长cDNA克隆中的应用

PCR技术的出现大大提高了传统基因分离和克隆效率。以PCR为基础的RACE(rapidam plificationofcDNAends)技术是一种简单、敏感且有效扩增cDNA的 5′和 3′端未知序列区域的方法。RACE技术被广泛应用于克隆全长cDNA 。

基于单细胞扩增技术的细菌多样性及功能基因分析

本研究采用单细胞扩增技术与宏基因组学相结合策略以期全面了解产妇肠道细菌多样性及基因功能信息,为深入理解微生物代谢特性及潜能提供理论基础。对来自5位健康产妇共计40份粪便样本稀释液进行细菌群落结构及基因功能组成分析,并鉴于短链脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)在孕期能量及免疫调节中的关键作用,进一步探讨其生物合成相关功能基因分布及与核心菌群相关性。共享核心菌门4个,依次为厚壁菌门(0.88%)、拟杆菌门(0.07%)、变形菌门(0.02%)和广古菌门(0.02%),其中厚壁菌门与拟杆菌门(17.59∶1)较普通健康成人(1∶1)差异显著;共享核心菌属25个,占样品微生物总量的77.99%,样本间差异显著。基因功能涉及转运因子、DNA修复、重组蛋白、核糖体等306个功能大类;相关性热图显示肠道细菌为难消化多糖转化SCFAs提供完整遗传代谢途径,其中拟杆菌门和厚壁菌门相关菌属分别在多糖降解和SCFAs生成中表现各自优势。细菌群落结构具显著妊娠特症,且属水平表现较大宿主特异性;其中SCFAs途径菌间代谢偏好差异及互补特性提示肠道细菌可能存在复杂的菌间互养cross-feeding网络,菌间合作为营养及能量高效摄取、增强孕产期能量储备提供可能。

几种主要的RACE技术及应用

cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)是一种对mRNA进行末端快速扩增的技术,具有快速、稳定、成功率高等优点。阐述了经典RACE、Adapter-Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switchingRACE、环形RACE和RCA-RACE的原理、优缺点及目前的应用,并提出了应用RACE技术的建议及RACE技术的应用前景,为实验人员选择最合适的RACE技术提供参考。

采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1

c DNA末端快速扩增 (RACE)技术是快速获得新基因 5′和 3′端未知序列的有效手段 .鉴于新报导的人肿瘤基因 MAGE家族成员之一 MAGE- D1的 c DNA序列不完全 ,从而拟用 RACE技术获得 MAGE- D1的全长 c DNA序列 .结果显示 ,MAGE- D1的 c DNA全长为 2 80 0个碱基 ,编码778个氨基酸 .同时对 RACE技术应用时的一些关键问题进行了讨论 .

中华绒螯蟹卵巢RACE cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术 ,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列 ,运用SMART技术 ,成功构建了中华绒螯蟹卵巢 (Ⅲ期 )RACEcDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,文库所含全长cDNA的长度主要集中在 5 0 0～ 2 0 0 0bp之间 ,RACEPCR结果表明 ,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物 ,说明所构文库的质量较好 ,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。

甘薯IbNPR1全长cDNA序列的分离与表达特性分析(英文)

在植物系统获得性抗性(SAR)中,NPR1蛋白是水杨酸介导的基因表达中关键调控因子。本研究以青农2号为试验材料,利用同源序列法和RACE技术分离甘薯SAR途径的主要抗病信号元件NPR1(none expresser of PR gene)的全长cDNA序列。序列分析表明,IbNPR1基因全长2353bp,包含一个编码586个氨基酸残基的开放阅读框,包含有类似拟南芥NPR1蛋白中的BTB/POZ和锚蛋白重复氨基酸序列结构域。聚类分析显示IbNPR1与来源于番茄的NPR1蛋白关系最近。Southern杂交及半定量RT-PCR分析表明,甘薯NPR1基因属于低拷贝基因家族,表达模式为组成型表达,并且SA能提高其表达水平。由该结果推测,IbNPR1可能在甘薯抵御病原物的侵染中起重要的作用。

巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)微管相关蛋白全长cDNA克隆及表达分析

从巴西橡胶树Heveabrasiliensis差减cDNA文库中分离到微管相关蛋白(Microtubule-associatedprotein,MAPs)基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)进行差异片段的5’和3’端的扩增,获得了长度为788bp的全长cDNA,该基因在GenBank中的登录号为AY461412。序列分析表明该基因包含完整的开放阅读框,编码144个氨基酸,与微管相关蛋白基因家族具有很高的同源性,推测该基因是微管相关蛋白基因。半定量RT-PCR检测证实它在胶乳中的表达强于叶中,胁迫处理(伤害及乙烯处理)使其表达上调。

人脑红蛋白(NGB)全长cDNA序列的克隆

人脑红蛋白 (neuroglobin ,NGB)是新发现的神经系统特异的携氧蛋白 ,然而其全长cDNA序列一直未见报道 .采用电子序列延伸技术和cDNA序列末端快速扩增技术 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE)研究发现 ,人NGB全长cDNA序列为 190 9bp,5′非编码区为 375bp ,编码区 (45 6bp)可编码 15 1个氨基酸 ,3′非编码区为 10 78bp,其中含 2 7bp的 poly (A) (GenBank接受号 :AF4 2 2 797) .综合采用电子序列延伸技术与RACE技术是获得全长cDNA序列的有效方法 ,为后续的功能研究提供了重要基础 .