水／离子液体[BMIM]PF6两相体系中全细胞催化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸

研究了水/离子液体两相体系中重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115(r-PGUS-P)全细胞转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应。确定最适反应体系为离子液体[BMIM]PF6/水(2∶8,体积比),最适缓冲液pH、反应温度、底物浓度和细胞加入量分别为5.4、45℃、6.0mmol.L-1和8.0g.L-1。在此条件下反应58h,产物GAMG得率和化学键选择性分别为69.6%和67.2%,与纯水相反应体系相比,分别提高了12.4%和12.61%。离子液体循环使用7次后,回收利用率为93.47%。产物GAMG和副产物甘草次酸(GA)在此两相体系中得到有效分离,为后续产物分离带来便利。

固定化细胞连续生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸

产紫青霉菌株(Penicillium purpurogenum Li-3)能定向转化甘草酸(GL)为单葡萄糖醛酸基甘草次酸(glycyrrtinic acid 3-O-mono-β-D-glucuronide,GAMG),针对课题组前期海藻酸钙包埋产紫青霉Li-3的珠体机械强度不高,操作使用性能低等问题,通过添加天然物质和化学处理改变凝胶结构,提高改性海藻酸钙珠体的机械强度,并考察了改性海藻酸钙固定化细胞的催化性质。利用改性海藻酸钙固定的产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)微球在具有隔离筛的改进型填充床反应器中连续转化甘草酸(GL)生产单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)。结果表明添加4%的硅藻土能够改善固定化细胞微球的机械强度,提高了反应的转化率。改性前后的固定化细胞微球的最适p H值和最适温度均未发生变化,但改性的固定化细胞反应转化率与对照相比分别提高了22%和30%。向底物中添加0.12%的吐温-80能进一步使GAMG的产量提高44%。同时,改性的固定化细胞微球具有较好的贮存稳定性和重复使用性。最后利用改性固定化细胞微球在具有隔离筛的改进型填充床反应器内实现了连续生产GAMG,在最佳反应条件下,GAMG的产量为0.193 g/(L·d),GL的转化率为34%,时空产率约为13.7μmol/(L·h)。利用改性固定化细胞微球在改进型的填充床反应器内进行连续反应生产GAMG,为建立高效全细胞转化甘草酸合成GAMG的反应体系奠定了基础。

响应面设计法优化单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)发酵转化培养基

以甘草酸(glycyrrhizin,GL)为底物,利用产紫青霉(Penicillium purpurogenum Li-3)液态发酵转化单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG),采用响应面设计法对初始发酵培养基进行优化。用部分因子分析法研究原始发酵培养基各成分对响应值的显著程度,发现甘草酸(GL)、NaNO3和K2HPO4的质量浓度对发酵产生GAMG的影响显著(P<0.01)。用中心组合设计确立甘草酸、NaNO3和K2HPO4的适宜质量浓度分别为2.8、3.0和0.8 g/L。在优化条件下进行发酵时,GAMG的转化率从75.49%提高到89.11%,比优化前提高了13.62%。

含离子液体体系中固定化细胞转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸

研究疏水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐([BMIM]PF6)与醋酸-醋酸钠缓冲液两相体系中,固定化产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3细胞转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应,并与缓冲液单相体系作为对照。确定了在[BMIM]PF6/缓冲液两相体系中,最适离子液体加入比例、缓冲液pH、反应温度、底物浓度分别为10%、5.83、5℃和6.0 mmol/L,在此条件下反应58 h,甘草酸转化率为87.03%,比缓冲液单相体系提高了15.02%。离子液体循环使用8次后,回收利用率维持在85.28%。主产物GAMG和副产物甘草次酸(GA)在两相体系中得到有效分离,为后续产物分离带来便利。

单葡萄糖醛酸甘草次酸高效生物制备菌种筛选及发酵工艺

甘草中含量较少的三萜类成分单葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)在药品、食品和化妆品领域具有较高的应用价值。生物制备法具有污染小、反应条件温和、底物特异性高和副产物少的优点。为改善GAMG的制备工艺,本研究对甘草产地根际土壤中菌种进行单一碳源平板初筛和液态发酵复筛,选育了可将甘草酸(GL)转化为GAMG的高效转化菌株土曲霉菌(TMZ05),并结合单因素实验及正交试验优化发酵工艺,最终确定其最优发酵工艺条件:底物质量浓度5 g/L、种子液菌丝体接种量40个、发酵温度30℃、发酵液初始pH 6、发酵时间3 d。在最优发酵工艺条件下,GAMG最高摩尔收率可达62.34%;β-葡萄糖醛酸苷酶酶活最高可达307.14 U/mL。

产单葡萄糖醛酸甘草次酸菌株的筛选及发酵条件的优化

从甘草土壤中筛选纯化得到一株产β-D-葡萄糖醛酸苷酶(β-D-glucuronidase,β-GUS)的菌株,采用常温室压等离子体诱变技术(ARTP)对原始菌株进行诱变,筛选得到高产突变菌株。经传代10次培养验证该菌株遗传性状稳定。通过菌落形态、显微镜制片观察和ITS序列比较确定菌株为蓝状真菌属,命名为Talaromyces sp.02。对其进行发酵产酶优化,确定发酵产酶的工艺。结果表明,以5 g/L的甘草酸为诱导剂,3 g/L的硝酸钠为氮源,初始p H 5.5,发酵温度30℃,10%的接种量,发酵144 h,在此条件下,该菌株可水解甘草酸(Glycyrrhizin,GL)生成单葡萄糖醛酸甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide,GAMG),产量可达4.03 g/L,且几乎无副产物甘草次酸的生成,其发酵产率可达到87.88%,葡萄糖醛酸苷酶的酶活为162.20 U/m L,是原始复筛菌株的3.23倍,是一株具有开发前景和应用潜力的葡萄糖醛酸苷酶生产菌株。

水/有机溶剂体系中产紫青霉全细胞催化合成单葡糖醛酸基甘草次酸

研究了产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3全细胞β-D-葡萄糖醛酸苷酶在水/有机溶剂体系中催化水解甘草酸,合成单葡糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应。确定了最适反应体系为水/叔丁醇(体积比为3∶7),最适反应条件为:底物甘草酸用量1.5g·L-1、反应温度45℃、pH值5.0、全细胞酶量7g·L-1、摇床转速120r·min-1,在此条件下反应48h,产物GAMG产率可达79.12%,全细胞酶具有较好的稳定性和可重复使用性,显示了良好的应用前景。

甘草酸转化单葡萄糖醛酸甘草次酸中催化酶的选择

甘草酸是甘草药材中的重要药用成分,将甘草酸定向转化成单葡萄糖酸甘草次酸可以提高其药物活性降低毒性。制备新鲜猪肝脏匀浆,离心切取肝脏溶酶体作为转化催化剂,通过紫外-分光光度法对反应产物进行分析,证实反应生成了单葡萄糖醛酸甘草次酸,几乎不生成甘草次酸,说明溶酶体选择性较高。

甘草酸酶催化水解单葡萄糖醛酸甘草次酸的反应溶剂研究

甘草酸(GL)是甘草类中药材中的有效成分,将甘草酸转化为单葡萄糖酸甘草次酸(GAMG)可以提高其药物活性并降低生物毒性。离心切取新鲜猪肝脏匀浆中间段溶酶体作为酶催化剂,用胆碱基深共晶溶剂作为反应溶剂进行酶催化水解反应,用紫外-可见分光光度法对反应产物进行分析,比较了两种介质下的反应转化率。

微生物转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸甘草酸

通过研究筛选得到一株微生物能够高效转化甘草酸生成单葡萄糖醛酸甘草酸,转化率约为90%。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度的研究(Ⅱ)——能水解甘草苷糖醛酸基酶的提纯与酶性质研究

以酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度为目的，对新分离筛选的甘Ｍ－２和甘Ｍ－６霉菌产的β－葡萄糖醛酸苷酶进行了分离提纯和酶学方面的研究。结果表明，两株菌产的β－葡萄糖醛酸苷酶被６０％饱和硫酸铵沉淀较好，经ＤＥＡＥ－ＣｅｌｕｏｓｅＤＥ５２离子交换层析柱梯度洗脱，得到纯酶，提纯倍数分别为１０．６７和６．１５倍，收率分别为３３．０％和２４．２％，其中甘Ｍ－２菌产β－葡萄糖醛酸苷酶只能将甘草苷水解成甘草次酸（ＧＡ）；甘Ｍ－６菌产β－葡萄糖醛酸苷酶水解甘草苷主要变成甜度很高的单葡萄糖醛酸基甘草苷（ＧＡＭＧ）；两种酶在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳都得到电泳单点，其酶蛋白相对分子质量分别为６００００和４２０００；酶反应最适ｐＨ分别为５．０和６．０，最适温度均为４０℃，均在ｐＨ４．０～８．０和２０～７０℃范围内相对稳定。

酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度的研究(Ⅰ)——能水解甘草苷糖醛酸基酶的微生物的选择与产酶的研究

以酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度为目标，研究了９种新菌株能产水解甘草苷糖醛酸基的β－葡萄糖醛酸苷酶产率。结果：细菌甘Ｅ－１、霉菌甘Ｍ－３和甘Ｍ－６等产β－葡萄糖醛酸苷酶较好，产率分别为５６．７３Ｕ／ｍｌ、４２．５２Ｕ／ｍｌ和３１．２６Ｕ／ｍｌ，产酶最佳培养时间分别为细菌１８ｈ和霉菌４８ｈ。酶解甘草苷的最佳反应条件为：ｐＨ６，反应时间为１２ｈ，反应温度为４０℃。

极耐热性β-葡萄糖醛酸酶的高效表达和酶学性质及其应用

从海栖热袍菌克隆出编码热稳定性β-葡萄糖醛酸酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,在大肠杆菌中得到高效表达。基因表达产物通过一步热处理后,酶纯度达电泳均一。纯化重组酶酶学性质研究表明,β-葡萄糖醛酸酶的最适反应温度为80oC,最适反应pH为5.0,pH5.8～8.2之间酶的稳定性较好,80oC的半衰期为2h,SDS-PAGE结果显示分子量为65.9kD,与理论推算值相吻合。以对硝基苯-β-葡萄糖醛酸苷(pNPG)为底物时,其动力学参数Km值0.18mmol/L,Vmax值为312u/mg。初步的应用分析表明,该重组酶能催化甘草酸转化为甘草次酸。

甘草次酸微生物的两种发酵酶解生产工艺比较的研究

通过实验室保藏的葡萄糖醛酸酶菌种HC-12发酵甘草转化甘草酸，采用单因素实验和复杂系统定向反馈优化两种方法进行发酵酶解工艺优化的研究，并对实验结果进行比较。优化得到最佳工艺条件为：发酵4d，酶解时间18h，酶解pH值为5．0，酶解温度为30℃，在此条件下可使甘草酸100％转化。通过比较两种发酵酶解工艺，复杂系统定向反馈优化方法能够较好较快地得到甘草次酸微生物发酵酶解生产工艺，该方法是一种快速准确的方法。

酵母细胞催化合成18α-甘草酸

18α-甘草酸(18α-GL)是一种齐墩果烷型皂苷,比其差向异构体18β-GL极性小、亲脂性好,更强的抗毒抗炎作用和更高的肝脏靶向性使18α-GL成为保肝护肝领域的主要药物成分。但目前18α-GL的制备方法污染大、效率低,亟需开发一种绿色简单地合成18α-GL的方法。利用酵母细胞异源表达糖基转移酶,通过全细胞催化方式鉴定出可催化18α-甘草次酸(18α-GA)特异性合成18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸(18α-GAMG)的糖基转移酶cGuCSyGT和催化18α-GAMG特异性合成18α-GL的糖基转移酶GgUGT1。进一步运用蛋白质结构预测和分子动力学模拟探究cGuCSyGT对18α-GA的催化活性比18β-GA低的原因。最后采用优化底物添加浓度、底盘细胞、底物添加时间、反应时间、培养基成分补加和底物溶剂的策略构建了酵母催化合成18α-GAMG和18α-GL的最优工艺,使18α-GAMG和18α-GL的产量分别达到(36.38±1.87)mg/L和(39.32±0.75)mg/L。本研究实现了18α-GAMG和18α-GL的微生物催化合成,可为18α-GL的微生物全合成提供理论基础和技术支撑。

离子液体[BMIM]BF_4对甘草酸及其衍生物色谱行为的影响

将离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[BMIM]BF。）加入到高效液相色谱流动相中，研究其对甘草酸（GL）及其衍生物甘草次酸（GA）和单葡萄糖醛酸基甘草次酸（GAMG）色谱行为的影响。结果显示，加入离子液体后的流动相能够明显改善色谱峰形、减少峰拖尾、增大峰面积和峰高、提高检测灵敏度，并缩短GL，GA及GAMG3种化合物的同时检测时间，提高检测效率。优化色谱条件为：InertSustain C18（4．6mm×250mmi．d．，5μm）反相色谱柱为分离柱，柱温40℃；甲醇-1．0mmol／L[BMIM]BF4（体积比81：19，乙酸调至pH3．0）为流动相，流速0．7mL／min，进样体积20μL，检测波长251nm。GL，GA及GAMG在5．00—100mg／L范围内线性关系良好（r≥0．9998），检出限分别为0．02，0．04，0．09mg／L；加标回收率分别为100．1％，98．0％，98．2％，RSD为0．18％～0．43％。同时测定GL生物转化体系中3种组分，结果满意。

反相高效液相色谱法同时测定甘草酸及其酶转化产物

甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）及其衍生物是一类具有重要生理活性的化合物。利用酶转化GL可以生成具有更高生理活性的单葡萄糖醛酸甘草次酸（glycyrrhetyl 3-O-mono-β-D—glucuronide，GAMG）。为了深入研究该酶对GL的生物转化特性，该文建立了一种能同时检测GL及其酶转化产物GAMG的高效液相色谱分析方法。采用Apollo C18分析柱，流动相V（甲醇）：V（水）：V（冰醋酸）=75：25：5，流速1．0mL／min，紫外检测波长254nm。在进样量为0．2—20μg内成良好的线性关系，GL的加样回收率为94．3％-103．2％，相对标准偏差为0．85％-2．53％；GAMG的加样回收率为92．6％-98．7％，相对标准偏差为1．45％-3．25％。方法准确、简捷、耗材低廉。

丙烯酸-2,4,6-三硝基苯乙酯的合成及热分解

以TNT、甲醛为原料,在弱碱性条件下反应合成得到2,4,6-三硝基苯乙醇(PicCH2CH2OH);PicCH2CH2OH在浓硫酸催化下和丙烯酸在甲苯中回流反应24h,合成得到丙烯酸-2,4,6-三硝基苯乙酯,产率为62%。采用紫外可见光谱(UV-Vis)、核磁共振氢谱(1HNMR)、红外光谱(FTIR)、质谱(MS)以及元素分析等对产物结构进行了表征。利用热重分析(TG)对产物热稳定性进行了研究,采用Kissinger方法和Ozawa方法计算其热分解活化能Ea分别为99.78,102.96kJ·mol-1。

甘草皂苷类化合物结构与保肝活性关系的DFT研究

三萜皂苷类化合物是中药甘草保肝作用的主要药效物质。本文以甘草中的三种皂苷类化合物甘草酸、单葡萄糖醛基甘草次酸和甘草次酸为研究对象,采用密度泛函理论方法(DFT)在B3LYP/6-31+G*水平上,对三萜皂苷类化合物进行量子化学计算。依据化合物的几何结构、NPA电荷、偶极矩、溶剂化能和前线轨道能等参数,分析甘草中皂苷类化合物的结构与保肝活性之间的关系,以期对中药甘草的深入研究与开发提供理论基础。计算结果表明,三种甘草皂苷类化合物的活性部位在五环三萜上,而糖环不是其药理活性部位,但是糖环的结构和数目会影响药物分子的理化性质。根据前线分子轨道能级之差ΔE值可知,三种化合物的保肝活性顺序为:GA>GAMG>GL。