水／离子液体[BMIM]PF6两相体系中全细胞催化生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸

研究了水/离子液体两相体系中重组毕赤酵母Pichia pastoris GS115(r-PGUS-P)全细胞转化甘草酸(GL)生成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应。确定最适反应体系为离子液体[BMIM]PF6/水(2∶8,体积比),最适缓冲液pH、反应温度、底物浓度和细胞加入量分别为5.4、45℃、6.0mmol.L-1和8.0g.L-1。在此条件下反应58h,产物GAMG得率和化学键选择性分别为69.6%和67.2%,与纯水相反应体系相比,分别提高了12.4%和12.61%。离子液体循环使用7次后,回收利用率为93.47%。产物GAMG和副产物甘草次酸(GA)在此两相体系中得到有效分离,为后续产物分离带来便利。

水/有机溶剂体系中产紫青霉全细胞催化合成单葡糖醛酸基甘草次酸

研究了产紫青霉Penicillium purpurogenum Li-3全细胞β-D-葡萄糖醛酸苷酶在水/有机溶剂体系中催化水解甘草酸,合成单葡糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的反应。确定了最适反应体系为水/叔丁醇(体积比为3∶7),最适反应条件为:底物甘草酸用量1.5g·L-1、反应温度45℃、pH值5.0、全细胞酶量7g·L-1、摇床转速120r·min-1,在此条件下反应48h,产物GAMG产率可达79.12%,全细胞酶具有较好的稳定性和可重复使用性,显示了良好的应用前景。

亲水性离子液体[EMIM]BF_4对固定化β-葡萄糖醛酸苷酶催化活性的影响

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法制备固定化β-葡萄糖醛酸苷酶;以1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([EMIM]BF4)/缓冲溶液均相体系为介质,研究了亲水性离子液体[EMIM]BF4对固定化酶生物催化甘草酸(GL)合成单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的影响.实验结果表明,当均相体系中[EMIM]BF4的体积分数为16%,pH为5.4,反应温度为50℃及摇床转速为200 r/min时,酶活力达到最高,并且明显优于纯缓冲溶液体系中的最高酶活.重复利用性实验结果表明,与纯缓冲液介质体系相比,固定化酶在含亲水性离子液体[EMIM]BF4的均相介质中表现出较好的操作稳定性.表观动力学参数和活化能数据表明,亲水性离子液体[EMIM]BF4在催化体系中能够增强酶和底物GL的亲和力,有效稳定酶-底物的过渡态,并降低反应活化能,而使固定化β-葡萄糖醛酸苷酶表现出较高的催化活性.

酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度的研究(Ⅱ)——能水解甘草苷糖醛酸基酶的提纯与酶性质研究

以酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度为目的，对新分离筛选的甘Ｍ－２和甘Ｍ－６霉菌产的β－葡萄糖醛酸苷酶进行了分离提纯和酶学方面的研究。结果表明，两株菌产的β－葡萄糖醛酸苷酶被６０％饱和硫酸铵沉淀较好，经ＤＥＡＥ－ＣｅｌｕｏｓｅＤＥ５２离子交换层析柱梯度洗脱，得到纯酶，提纯倍数分别为１０．６７和６．１５倍，收率分别为３３．０％和２４．２％，其中甘Ｍ－２菌产β－葡萄糖醛酸苷酶只能将甘草苷水解成甘草次酸（ＧＡ）；甘Ｍ－６菌产β－葡萄糖醛酸苷酶水解甘草苷主要变成甜度很高的单葡萄糖醛酸基甘草苷（ＧＡＭＧ）；两种酶在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳都得到电泳单点，其酶蛋白相对分子质量分别为６００００和４２０００；酶反应最适ｐＨ分别为５．０和６．０，最适温度均为４０℃，均在ｐＨ４．０～８．０和２０～７０℃范围内相对稳定。

酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度的研究(Ⅰ)——能水解甘草苷糖醛酸基酶的微生物的选择与产酶的研究

以酶法改变甘草苷糖醛酸基提高其甜度为目标，研究了９种新菌株能产水解甘草苷糖醛酸基的β－葡萄糖醛酸苷酶产率。结果：细菌甘Ｅ－１、霉菌甘Ｍ－３和甘Ｍ－６等产β－葡萄糖醛酸苷酶较好，产率分别为５６．７３Ｕ／ｍｌ、４２．５２Ｕ／ｍｌ和３１．２６Ｕ／ｍｌ，产酶最佳培养时间分别为细菌１８ｈ和霉菌４８ｈ。酶解甘草苷的最佳反应条件为：ｐＨ６，反应时间为１２ｈ，反应温度为４０℃。

甘草皂苷生物转化的研究

目的 对甘草皂苷糖链进行有选择的部分水解 ,以得到单葡萄糖醛酸基甘草皂苷元。方法 生物酶水解法和液体发酵转化法。结果 利用试验菌最佳产酶条件所产的酶水解甘草皂苷 ,获得产物的产率为 2 3.7%。在液体发酵法中 ,产物的产率约为 10 %。产物可用 85 %乙醇从 HP2 0树脂柱上洗脱下来 ,同时未转化的甘草皂苷可用5 0 %乙醇洗脱而循环利用。结论 该方法简洁方便 ,提高了甘草皂苷的转化率。

重组β-葡萄糖醛酸苷酶键选择性的半理性改造

为了提高Escherichia coli重组表达的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-E)的键选择性,本研究以PGUS-E结构与功能关系的推测为指导,选择了可能影响PGUS-E的键选择性的R329、T369、N467位点进行定点饱和突变,利用薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对键选择进行筛选,得到优势突变酶R329K、T369V。结果显示:与PGUS-E酶相比,突变酶R329K、T369V键选择性分别提高26.9%、34.3%。突变酶的酶学性质研究表明,突变酶的最适p H和温度与PGUS-E一致,但其酶催化效率下降。由此可见,R329、T369对酶催化的键选择性和酶的活性有显著影响。综上结果,本文应用饱和突变方法改善了PGUS-E的键选择性,为酶的结构和功能关系理解提供了实验依据。

乌拉尔甘草皂苷类成分研究

目的研究乌拉尔甘草Glycyrrhiza uralensis根及根茎的化学成分。方法应用溶剂法和色谱法进行分离纯化,利用波谱技术鉴定化合物结构;并测试化合物的细胞毒活性。结果从乌拉尔甘草50%乙醇提取物中分离得到14个皂苷类化合物,分别鉴定为uralsaponin C(1)、uralsaponin D(2)、licorice-saponinA3(3)、uralsaponin F(4)、22β-acetoxyl-glycyrrizin(5)、24-hydroxyl-licorice-saponin E2(6)、licorice-saponin E2(7)、licorice-saponin G2(8)、22β-acetoxyl-glyrrhaldehyde(9)、3β-O-[β-D-glucuronopyranosyl-(1→2)-β-D-glucuronopyranosyl]-glycyrreto(l 10)、araboglycyrrhizin(11)、licorice-saponin J2(12)、甘草酸(13)、单葡糖醛酸基甘草次酸(14)。化合物1～14对3种人源肿瘤细胞MGC-803、SW620、SMMC-7721的半数抑制率(IC50)均大于100μmol/L,化合物2、6～8、13的水解后苷元对3种人源肿瘤细胞的抑制率为18.3～41.6μmol/L。结论化合物14是一个新的天然产物,化合物11为首次从该植物中分离得到;化合物1～14对3种人源肿瘤细胞MGC-803、SW620、SMMC-7721均无显著的细胞毒活性,化合物2、6～8、13水解后苷元细胞毒活性增强。

高效液相色谱法同时测定甘草酸及其发酵产物

建立甘草酸发酵液中甘草酸及其发酵产物乌拉尔甘草皂苷乙、3-O-β-D-葡萄糖醛酸-24-OH-18β-甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和甘草次酸的RP-HPLC含量测定方法,为单葡萄糖醛酸甘草次酸的生产工艺研究及产品质量控制提供方法学基础。采用Kromasil C18（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,以甲醇（B）-1%乙酸溶液（A）为流动相进行梯度洗脱：0 min,63%B;40 min,66%B;50 min,75%B;70 min,90%B;80 min,90%B。体积流速：1.0 mL/min;进样量：10μL;柱温：25℃;检测波长：254 nm。甘草酸、乌拉尔甘草皂苷乙、3-O-β-D-葡萄糖醛酸-24-OH-18β-甘草次酸、单葡萄糖醛酸甘草次酸、18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸和甘草次酸的线性范围分别为11.25-180.0μg/mL（r=0.9986）;3.031-96.99μg/mL（r=0.9978）;2.595-83.00μg/mL（r=0.9999）;62.50-2000μg/mL（r=0.9999）;11.25-180.0μg/mL（r=0.9980）;1.560-50.00μg/mL（r=0.9992）;平均回收率（n=9）分别为98.3%,101.2%,98.4%,101.9%,101.7%,97.42%,RSD分别为2.5%,1.4%,0.96%,2.8%,0.73%,0.32%。