以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒的构建

目的构建以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒用于药物作用机制的快速鉴别。方法通过使用分泌型荧光素酶(Gluc)序列替代流感病毒HA基因,并利用表达质粒反式提供HA蛋白,借助甲型流感病毒WSN反向遗传学产毒系统,构建带有报告系统的单轮感染流感病毒。结果首轮接种单轮感染流感病毒的细胞上清中可以检测到Gluc信号,但检测不到病毒滴度,而在第二轮感染的细胞上清中检测不到Gluc信号,表明该单轮感染病毒在感染过程中能够分泌Gluc蛋白并且不能产生具有感染性的子代病毒颗粒。通过对复制动力学和时相的观察,明确了单轮感染病毒的生活周期,同时结合4种已知作用机制的抗流感药物的阻断实验结果,证明该系统可以用来快速、有效地鉴别药物的作用机制。结论成功构建了以分泌型荧光素酶为报告基因的单轮感染流感病毒,该系统可以用于抗病毒药物作用机制的快速鉴别。

YFV17D非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立

构建YFV17D非感染性复制子及假病毒包装系统,旨在进一步解析黄热病毒的复制、组装分子机制。该研究利用反向遗传学技术,将基于SP6启动子的单拷贝YFV17D报告复制子改造成由CMV启动子驱动的低拷贝YFV17D报告复制子,同时将表达YFV17D结构蛋白的包装质粒与复制子质粒共同转染BHK-21细胞而建立YFV17D的反式假病毒包装系统。通过检测NanoLuc萤光素酶活性(Nluc)、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达、间接免疫荧光实验监测病毒双链RNA来确定复制子在BHK-21细胞中复制情况和包装效果。结果表明,与复制缺陷型复制子相比,野生型复制子转染至BHK-21细胞中,随着转染时间的增加,Nluc活性、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达也随之增加,同时dsRNA也随时间延长而增多。将复制子质粒和包装质粒共同转染至BHK-21细胞后,收集上清再次感染BHK-21细胞,随后通过检测Nluc活性和oxGFP与mCherry蛋白的表达而确定假病毒包装成功。综上,成功构建了携带不同报告基因的YFV17D复制子,用于监控病毒基因组RNA的复制;成功搭建由包装质粒提供的结构蛋白,将不具备感染性的YFV17D亚基因复制子打包成具有单轮感染能力的YFV17D假病毒系统。