橡胶树棒孢霉落叶病菌酵母单杂交cDNA文库及CcCas5启动子诱饵载体的构建

为了筛选出与CcCas5启动子结合的转录因子,本研究构建了橡胶树棒孢霉落叶病菌的酵母单杂交cDNA表达文库和CcCas5启动子诱饵载体,并对3-氨基-1,2,4-三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)的最佳抑制浓度进行了筛选。结果显示,构建的酵母单杂交cDNA表达文库总容量为3.49×10^(6)cfu,插入片段主要分布于750~2000 bp之间,重组率为95.8%;克隆了CcCas 5基因2600 bp的启动子序列,预测获得真菌主要的10大类转录因子的结合位点165个;构建了分别携带1500 bp和1000 bp启动子序列的酵母单杂交启动子诱饵载体,10 mmol/L的3-AT能抑制pHis2.1-pCcCas5-1000和pHis2.1-pCcCas5-1500的背景表达。试验结果为通过酵母单杂交筛选与CcCas5启动子结合的转录因子和进一步研究转录因子对CcCas5表达的调控作用奠定基础。

辣椒CaWRKY39基因克隆及其酵母单杂交pGADT7载体构建

辣椒是我国重要的经济作物之一,但番茄斑萎病毒(TSWV)极易造成其巨大的生产损失,亟需有效的防治策略。前期研究发现,辣椒转录因子CaWRKY39在TSWV侵染下特异性高表达,推测其可能在辣椒抗TSWV中发挥重要作用。本研究从辣椒‘萧新19’叶片中克隆了CaWRKY39基因,并对其进行生物信息学分析,结果表明,CaWRKY39的CDS全长为1 035 bp,编码一个由344个氨基酸组成、相对分子量为38 570.53 Da、理论等电点为9.59的稳定疏水蛋白,该蛋白二级结构和三级结构主要由无规则卷曲构成,占比为60.76%。系统进化分析发现CaWRKY39蛋白与棉花GhWRKY39蛋白亲缘关系最近,表明两者功能可能具有相似性。为进一步验证CaWRKY39对相关抗性基因的靶向调控作用,采用RT-PCR技术扩增CaWRKY39基因CDS序列,利用NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切,并通过无缝克隆的方法成功构建了酵母单杂交表达载体pGADT7-CaWRKY39。本研究结果可为深入研究CaWRKY39转录因子参与辣椒抗TSWV病毒的分子机理提供技术支持和参考。

酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的应用

酵母单杂交系统是由酵母双杂交系统衍生来的研究DNA与蛋白质之间相互作用的新型系统。该文系统阐述了单杂交系统的基本原理和技术路线,详细综述了其在植物基因工程各个领域的应用研究进展,即克隆抗渗透胁迫类转录因子基因,确定已知DNA与蛋白质之间的相互作用,定位已证实的具有相互作用的DNA结合结构域以及验证转录激活作用;并分析了当前该系统在植物基因工程研究中存在的问题,进而结合自己的研究对解决问题的途径进行了探讨。

酵母单杂交的原理与应用实例

许多诱导型基因的表达 ,都受特定的转录因子和顺式元件调控。要阐明各种信号传递途径与基因表达调控的机理 ,克隆和鉴定转录因子是关键。近年来酵母单杂交方法被广泛应用于克隆和鉴定各种动植物的转录因子 ,本文以拟南芥DREB转录因子的克隆为例 。

酵母单杂交筛选人食管癌细胞系SHEEC中NF-kappa B元件结合蛋白

背景与目的:从食管癌细胞cDNA文库中筛选能够特异性结合NF-kappaB核心元件的蛋白质分子,探讨NGAL基因的表达调控机制,探寻NGAL基因在食管上皮细胞癌变中过表达的原因。材料与方法:应用酵母单杂交系统,以三重NF-kappaB元件寡聚核苷酸串为诱饵,对人食管癌细胞系SHEECcDNA酵母杂交文库进行筛选,应用DNA测序及生物信息学技术对筛选克隆进行分析。结果:共获得30个阳性克隆,包括4种编码蛋白,2个hypotheticalprotein,2种线粒体基因,3类非编码RNA等。结论:应用酵母单杂交手段筛选出食管癌细胞NF-kappaB核心元件结合蛋白,但只是一种初步的实验,还需进一步研究证实。

毛白杨酵母单杂交体系的建立

【目的】通过建立酵母单杂交文库筛选出与毛白杨特异性调控元件结合的候选蛋白,为研究毛白杨木材合成相关基因奠定基础。【方法】采用模板基因PCR方法,分别将ABRE-box、AC-box及-317-Box三次重复序列连接至p Ab Ai诱饵质粒上,再将诱饵载体转入酵母中;使用磁珠法获得m RNA,采用SMART技术合成c DNA,以c DNA为模板进行LD-PCR并将产物纯化后与p GADT7-Rec载体共转化诱饵酵母,同时进行文库的构建与筛选。【结果】以p BI121质粒为模板扩增获得的ABRE/AC/-317-GUS片段约为650 bp。以KpnⅠ对重组质粒p Ab Ai-ABRE/AC/-317-GUS进行单酶切,获得约5000 bp的大片段与650 bp的小片段;测序结果表明,插入序列与ABRE/AC/-317序列一致且方向正确。在SD/Ura培养基中,当Ab A为100 ng/m L时,酵母菌落数为0,建库时Ab A为100 ng/m L。c DNA与p GADT7载体共转化的酵母Y1HGold(p AC-Ab Ai)细胞稀释100倍后,在SD/-Leu培养基上长出89个克隆,含AC-box的诱饵酵母所建库容量为1.3×106,且无r RNA污染。酵母转化产物在SD/-Leu/Ab A(100 ng/m L)培养基上长出18个克隆,大于250 bp的有13个克隆;测序和同源分析结果表明,成功筛选到5个候选蛋白,主要是蛋白激酶、核小体蛋白及功能未知蛋白,这些蛋白可作为与AC元件结合的候选蛋白。【结论】建立的毛白杨酵母单杂体系可用于进一步筛选与木材合成相关的基因。

酵母单杂交系统在植物抗渗透胁迫转录因子研究中的应用

酵母单杂交系统是由酵母双杂交系统衍生来的研究DNA与蛋白质之间相互作用的新型系统。系统阐述了单杂交系统的基本原理和技术路线,详细综述了其在植物抗渗透胁迫转录因子各个研究领域的应用进展,即克隆抗渗透胁迫类转录因子基因,确定已知DNA蛋-白质的相互作用,定位已证实的具有相互作用的DNA结合结构域以及验证转录激活作用。分析了当前该系统在植物抗渗透胁迫转录因子研究中存在的问题,进而对解决问题的途径进行了探讨。

酵母单杂交技术的原理及应用

0引言 酵母单杂交(yeast one hybrid)技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法,通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析,来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因,或对DNA结合位点进行分析.运用此技术,能筛选到与DNA结合的蛋白质,并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列,而无需复杂的蛋白质分离纯化操作,故在蛋白研究中,具有一定的优势;而且,酵母属真核细胞,通过酵母系统得到的结果比其他体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的真实情况.

酵母单杂交体系——一种研究DNA-蛋白质相互作用的有效方法

酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的基本原理 ,通过观察酵母细胞内报告基因的表达状况 ,研究DNA-蛋白质之间的相互作用。通过筛选 DNA文库可直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列 ,而无需分离、纯化蛋白 ,从而克服了体内研究的局限性。目前酵母单杂交体系已被广泛应用于寻找与目的 DNA片段相互作用的蛋白质分子 ,该体系是一种用于研究 DNA-蛋白质之间的相互作用的有效方法。本文就酵母单杂交体系的原理、具体实现方法、在研究 DNA结合蛋白质中的应用及其优缺点等方面作一简要介绍。

木薯干旱胁迫下离区发育相关基因MeAP_(2-2)酵母单杂交文库构建及其上游调控基因的筛选

为了研究干旱胁迫下调节木薯叶片脱落相关的重要节点基因及其分子调控网络,以‘华南5号’木薯为实验材料,通过采用酵母单杂交筛选系统,将Me AP2-2启动子中激素与胁迫相关的元件串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术进行离区c DNA文库的构建,将离区c DNA与p GADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内筛选Me AP2-2的上游转录调节因子;利用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的c DNA插入片段,测序后在JGI网站进行Blast分析。结果表明,构建的c DNA文库库容为1.5×106,插入片段大小为250-3000 bp。c DNA插入片段经测序和Blast同源性分析和定量PCR分析,筛选出1个metallothionein protein,1个core histone protein,1个heavymetal-associated protein与Me AP2-2相关的调节因子。实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了调节Me AP2-2的上游调节因子。为研究木薯干旱胁迫下离区发育的信号转导通路奠定了基础。

应用酵母单杂交体系筛选与大鼠谷胱甘肽S-转移酶P增强子GPEⅠ相互作用的转录激活因子

目的 探讨谷胱甘肽 S-转移酶 (GST- P)基因表达调控机制的多样性及其与化学致癌的关系 ,筛选与大鼠 GST- P增强子元件 GPE 相互作用的调控因子。方法 采用酵母单杂交体系筛选与 GPE 核心序列相互作用的转录激活因子 ,应用 DNA序列测定及计算机分析等手段对所测的 DNA序列进行分析。结果 共获得两个阳性克隆 p YGPE1和 p YGPE2。 DNA测序分析表明 :p YGPE1的插入片段与大鼠原癌基因 c- jun c DNA具有 99%的同源性 ,其编码的氨基酸序列与大鼠 c- Jun蛋白具有 10 0 %的同源性。 p YGPE2的插入片段与大鼠线粒体腺苷酸转位酶 c DNA具有 99%的同源性 ,其编码的氨基酸序列与大鼠腺苷酸转位酶具有 10 0 %的同源性。结论 大鼠 c- Jun蛋白和线粒体腺苷酸转位酶在酵母细胞内与大鼠 GST- P增强子 GPE 核心序列结合 ,可能是作用于 GPE 的反式作用因子。

辣椒酵母单杂交系统的建立及调控CaWRKY40表达的转录因子分离

辣椒CaWRKY40的转录表达受到病原菌和高温的诱导并在辣椒抗青枯病以及耐高温中起着重要的作用,但其应答青枯菌侵染和高温胁迫表达的调节机制还不清楚。为了进一步分离调节CaWRKY40表达的转录因子,建立辣椒酵母单杂交cDNA文库,以CaWRKY40启动子的青枯病原菌及高温应答区域CaWRKY40p(W40p)为诱饵,筛选cDNA文库,共获得56个阳性克隆。序列分析结果表明,有27个克隆为非重复序列,对其推定氨基酸序列进行同源比对和功能结构域分析,发现有1个推定转录因子,即ARF(Auxin response factor),以及其他蛋白如eIF(Eukaryotic initiation factor,真核起始因子),EF(延伸因子,Elongation factor)等。进一步通过染色质免疫共沉淀验证这些转录因子与W40p的结合。剖析CaWRKY40表达的分子机制有利于深入解析CaWRKY40介导的辣椒抗病及耐高温分子机制。

利用酵母单杂交方法筛选大豆根融合基因表达cDNA文库

酵母单杂交体系通过筛选cDNA文库可直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列,是研究DNA-蛋白质相互作用和转录因子功能的最常用、最有效的方法之一。通过构建与Gal4p的激活结构域融合的表达cDNA文库,利用抗病相关基因启动子区的W-box顺式元件采用酵母单杂交方法对该文库进行了筛选,共得到4个阳性克隆。结果为进一步研究与顺式元件W-box相互作用的WRKY蛋白奠定了基础。

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选,应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果:共获得了12个双阳性克隆,编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白,其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论:这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合,可能是作用于SPⅠ的反式作用因子,但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用,笔者正进行进一步的研究。

酵母单杂交诱饵质粒pHis-3NF和pLacZ-3NF的构建与鉴定

目的 :构建可以与酵母染色体组发生重组的质粒 pHis_NF和 pLacZ_NF。 方法 :人工合成44bp的三重NF_κB元件寡聚核苷酸 ,通过DNA重组技术将靶序列NF_κB串定向插入细菌_酵母穿梭质粒pHisi和pLacZi的多克隆位点MCS后 ,用特异性酶切、琼脂糖凝胶电泳、PAGE电泳、DNA测序等方法进行鉴定。 结果 :PAGE电泳和DNA测序分析证实定向插入的寡聚核苷酸串与预先设计的插入序列一致。 结论 :成功地构建了重组质粒 pHis_3NF和 pLacZ_3NF ,为借助酵母单杂交实验技术平台深入探讨NF_κB因子相关基因的转录调控机制奠定了实验材料和技术基础。

筛选G-box结合蛋白的酵母单杂交文库的构建

目的：筛选花青素合成中的关键基因查尔酮合成酶基因CHS启动子中G-box的结合蛋白,从而找到调节CHS表达的转录因子。方法：采用Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System,将CHS启动子G-box序列串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用SMART技术合成芜菁幼苗下胚轴cDNA,将该cDNA与pGADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内同步进行cDNA文库的构建和筛选;用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的cDNA插入片段,测序后在NCBI网站进行Blast分析。结果：共筛选了2.52×106个酵母克隆,得到94个阳性克隆,菌落PCR获得了长度为0.4~2.0 kb的cDNA插入片段,并通过Blast推测了其编码蛋白。结论：实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了G-box结合蛋白的候选蛋白,为研究CHS的表达调控奠定了基础。

不同生长时期罗汉果果实转录因子的转录组分析及酵母单杂交文库的构建

目的:研究罗汉果果实中的转录因子(transcription factors,TFs)。方法:在授粉后3、50、70 d(days after flowering,DAF)的罗汉果果实转录组中查询注释为转录因子的所有非重复Unigene,并在表达谱中查找其表达情况;应用Matchmaker Yeast One-Hybrid Library Construction系统构建酵母单杂交c DNA文库。结果:罗汉果表达谱数据中共有38个家族的119个转录因子Unigene具有表达差异,其中以70 DAF/3 DAF和50 DAF/3 DAF组中具有差异表达的转录因子数目较多,且上调和下调的转录因子Unigene数目相近。此外,初步筛选到4个可能参与罗汉果甜苷合成调控的b HLH(basic helix-loop-helix,b HLH)转录因子Unigene(b HLH014、b HLH025、b HLH093、b HLH096)及8个可能参与黄酮类化合物合成调控的MYB转录因子Unigene;成功构建了酵母单杂交文库p GADT7-Rec2-Lib,其库容量为2.3×106 cfu,插入片段的平均长度约为1.5 kbp。结论:转录组数据分析和酵母单杂交实验有助于筛选罗汉果果实中具有调控作用的转录因子。

一种快速准确构建酵母单杂交系统报道子的方法

酵母单杂交系统是根据DNA结合蛋白 (即转录因子 )与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因 ,其中构建带有不同DNA顺式作用元件的报道子是该系统的重要环节。目前 ,构建酵母单杂交系统报道子主要采用随机串联的方法 ,由于串联的顺式作用元件的个数和方向不能控制 ,所以筛选报道子费时费力。尝试采用同尾酶定向克隆的方法 ,将顺式作用元件按相同方向和所需的个数串联起来 ,减少了筛选报道子所需的时间和费用。

酵母单杂交筛选实验中的关键问题

目的酵母单杂交系统是研究生物大分子DNA和蛋白质间相互作用的有效手段之一,酵母单杂交筛库实验是获取可以和诱饵序列相互作用的反式作用因子的关键。方法酵母单杂交诱饵质粒pHISi3NF转化YM4271;通过不同浓度3-AT实验,获得酵母单杂交用宿主细胞YM4271pHISi3NF4;大规模筛选人食管癌细胞cDNA文库。结果经筛库后续验证实验证实得到阳性克隆。结论通过准确确定3-AT的工作浓度,有效地完成了酵母单杂交的大规模筛选人食管癌细胞cDNA文库的实验。

玉米大斑病菌黑色素合成还原酶基因酵母单杂交报告载体的构建

根据玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)黑色素合成还原酶基因St3HNR、St4HNR 5′端侧翼序列和酵母单杂交报告载体p HIS2.1多克隆位点,设计了带有限制性内切酶位点的特异性引物,并以玉米大斑病菌01-23菌株基因组DNA为模板,PCR扩增启动子区域长度约1 000 bp的片段,双酶切目的片段及载体p HIS2.1回收并连接,构建2个还原酶基因的酵母单杂交报告载体。结果表明,克隆到启动子区域长度为998 bp核酸片段,经PCR检测、测序、酶切鉴定,2个还原酶基因的酵母单杂交报告载体构建成功,为进一步研究还原酶与转录因子互作关系及明确黑素素合成调控机制奠定了基础。