抗肝癌单链双功能抗体在Hut-78细胞系中的表达及体外杀伤活性

目的 用携带分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因(sFv TNF α)的重组逆转录病毒感染T细胞淋巴瘤Hut 78细胞 ,使其表达并分泌针对人肝癌细胞的sFv TNF α融合蛋白 ,观察转导的T细胞对体外培养肝癌细胞的杀伤作用 .方法 用感染性重组病毒产生细胞C2 2 (PA317/PST)产生的病毒上清转导人T细胞淋巴瘤Hut 78细胞 ,采用PCR、RT PCR、细胞原位杂交及免疫组织化学染色等方法 ,对转导的Hut 78细胞进行DNA、mRNA及蛋白水平的分析 .转导的Hut 78细胞分别与SMMC 772 1、HHCC共培养 ,MTT法检测Hut/PST细胞表达产物对两种肝癌细胞的杀伤作用 .结果 PCR、RT PCR结果显示转导Hut细胞中扩增出外源目的基因对应的电泳条带 .neo基因探针原位杂交显示转导细胞质内有较强的紫蓝色阳性反应信号 ,其阳性率约为 95 % .鼠抗人TNF α多克隆抗体免疫组织化学染色 ,转导细胞质内有明确的棕黄色阳性反应信号 .MTT法检测结果 ,分泌型抗肝癌单链双功能抗体对体外培养的两种肝癌细胞的杀伤率分别为 15 .4 %和2 6 .5 % .结论 分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因可以在T细胞中整合并稳定表达 ,其分泌的表达产物对两种肝癌细胞均具有一定的亲合活性 ,并且具有一定的体外杀伤作用 .

抗PRRSV双功能单链抗体基因的构建、序列分析及蛋白结构预测

为构建抗PRRSV与抗人红细胞单链抗体(2E8-Sc Fv)融合的双功能单链抗体基因并预测其结构和功能,本研究以PRRSV杂交瘤细胞株为模板,通过RT-PCR和SOE-PCR构建PRRSV-Sc Fv基因,将其重组到2E8-Sc Fv C端构建双功能单链抗体基因并测序分析,利用生物信息学软件预测其结构功能。结果显示,成功获得长735 bp的PRRSV-Sc Fv基因,由Linker、VH和VL组成,VH、VL均含明确的CDR和FR区及特征性Cys,与多种鼠源Sc Fv基因高度同源,具有重组功能性鼠源抗体可变区特征,与2E8融合后形成全长1 470 bp的2E8-PRRSV-Sc Fv基因。经生物信息学分析,融合基因编码490个氨基酸,亲水性评估值为-0.365,为亲水性蛋白;结构预测分析显示,其存在丰富的二级结构,可折叠形成含有多个沟槽结构的空间构象,利于抗原的结合,理论上具有良好的抗原结合活性。本研究成功构建抗PRRSV双功能单链抗体基因并对其编码的蛋白质结构进行了预测,为今后进行融合蛋白的表达及最终研究PRRSV抗原快速检测方法奠定基础。

抗人红细胞/抗猪瘟病毒双功能单链抗体的制备及功能鉴定

旨在构建检测猪瘟病毒(CSFV)的双功能单链抗体。通过连接肽将抗人红细胞膜H抗原单链抗体基因2E8-ScFv和抗猪瘟病毒单链抗体基因CSFV-ScFv拼接成融合基因,大肠杆菌密码子优化及人工合成后,构建原核表达载体pCzn1-2E8-CSFV,转化BL21(Plyss)进行重组蛋白IPTG的诱导表达,利用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定,通过间接免疫荧光(IFA)、ELISA和血凝试验,验证重组蛋白双功能活性。结果表明,重组蛋白主要以包涵体形式在大肠杆菌中表达,分子质量约为55 kDa。IFA和ELISA结果表明,纯化复性后的重组蛋白与猪瘟病毒具有良好的结合活性;红细胞凝集试验表明,重组蛋白能与人红细胞特异性结合,同时也能与猪瘟病毒发生特异性结合,具有双功能特性。本研究成功表达了抗人红细胞膜H抗原/抗猪瘟病毒双功能单链抗体,为进一步构建猪瘟病毒红细胞凝集试验快速检测方法奠定基础。

抗肝癌sFv-TNF-α基因逆转录病毒包装细胞系的建立

目的 :将分泌型抗肝癌单链双功能抗体基因 (sFv -TNF -α)克隆至逆转录病毒载体pLXSN ,包装并筛选具有高滴度感染性重组病毒产生细胞系。方法 :用平 -粘末端连接方法将sFv-TNF -α克隆至pLXSN ,磷酸钙共沉淀法转染PA31 7包装细胞并测定病毒滴度 ,用PCR及免疫组化方法分析鉴定重组逆转录病毒细胞系。结果 :成功构建了表达载体pLXSN -sFv-TNF -α ,筛选出一株cfu >1× 1 0 9·L- 1 的感染性重组病毒产生细胞系C2 2 。结论 :外源基因整合到转染细胞DNA中并表达 。

利用基因芯片对MxIRT1蛋白膜泡在铁胁迫条件下外排途径的研究

本文以研究缺铁条件下Mx IRT1蛋白膜泡在细胞中的外排途径机制为目的,采用基因芯片方法,发现在铁胁迫环境中,膜泡运输通路相关基因上调表达,推测Mx IRT1蛋白膜泡通过粗面内质网运送至高尔基体,然后通过内体再运送至质膜。该研究有助于进一步研究高等植物中Mx IRT1蛋白相关的铁转运机制。