抗人胎盘酸性铁蛋白单链抗体的构建、表达与鉴定

目的:制备人胎盘酸性铁蛋白(PAF),构建、表达并鉴定抗人PAF单链可变区抗体片段(scFv)。方法:设计以SfiⅠ、NotⅠ为酶切位点、以(Gly4Ser)3为linker的2对引物,从抗人PAF单克隆抗体可变区基因的克隆载体中扩增VH和VL基因,用重叠延伸PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,构建VH-linker-VL的scFv基因。经SfiⅠ、NotⅠ酶切后克隆到原核分泌型表达载体pUC19/119上,转化大肠杆菌TG1和筛选后测序验证,IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量(Mr)。以人PAF为抗原,scFv为一抗,抗His单克隆抗体为二抗,间接ELISA鉴定其抗体活性。结果:重叠延伸PCR扩增产物经凝胶电泳可见约700bp的条带,DNA序列分析证明2株抗体具有完整的scFv序列,并含有c-myc和His。IPTG诱导阳性菌表达产物经SDS-PAGE鉴定有Mr约27000的显示条带,符合scFv与表达标签融合蛋白的理论值;间接ELISA证明表达产物可与PAF结合。结论:成功构建并表达了抗人PAF单链抗体,为进一步建立检测PAF的间接ELISA奠定了基础。

双单链抗体夹心法诊断汉坦病毒感染的初步研究

目的制备检测汉坦病毒感染的双单链抗体夹心ELISA诊断试剂,并予以评价。方法以抗汉坦病毒NP抗原单链抗体包被反应板,以辣根过氧化物酶(HRP)标记大肠埃希菌表达的抗NP抗原单链抗体,并制成双单链抗体夹心诊断试剂,检测56份早期肾综合征出血热(HFRS)患者血清及66份非HFRS对照血清。结果56份HFRS患者血清中,检测出29例阳性,阳性率为51.8%,对照组66例,检测结果均为阴性。结论研制的试剂特异性好,价格低廉。

特异性结合革兰氏阴性菌外膜蛋白C的单链抗体核糖体展示文库的构建

以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白Omp C免疫BALB/c小鼠,提取骨髓浆细胞总RNA,逆转录获得c DNA,作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。由(Gly4Ser)3 linker连接两片段,获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCR添加T7启动子、核糖体结合位点、gⅢtether和两端茎环结构等元件,成功构建对外膜蛋白C具有特异性亲和力的单链抗体可变区的核糖体展示文库,为特异性强、亲和力高的单链抗体可变区筛选提供了技术和材料基础。构建能与革兰氏阴性菌外膜蛋白C特异性结合的鼠源单链抗体核糖体展示文库,是奠定构建饲料革兰氏阴性腐败菌分子预警和靶向抗菌剂的靶向定位区的高亲和力单链抗体可变区片段的重要基础,对建立有害革兰氏阴性菌分子检测方法和靶向抗革兰氏阴性菌菌剂设计方法具有借鉴作用。

应用噬菌体展示随机12肽库筛选诺如病毒抗原模拟表位

目的:利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒(NoV)的抗原模拟表位。方法:包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体(scFv),用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。ELISA鉴定淘选所得噬菌体与scFv的结合活性及其与NoV P蛋白的竞争作用;阳性克隆测序后进行生物信息学分析,合成多肽鉴定其抗原性。结果:发现1段与GⅡ.6 VP1区同源性较高的氨基酸序列“MG-D-W”,综合分析提示其可能为GⅡ.6 NoV的抗原模拟表位,且合成的包含“MG-D-W”的多肽可竞争抑制P蛋白与人类组织血型抗原(HBGAs)受体的结合。结论:“MG-DW”是与NoV单链抗体高亲和力的肽段,可能模拟了GⅡ.6 NoV与scFv结合的抗原表位。

融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析

目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。