抗人HBsAg单链抗体基因的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建抗人HBsAg单链抗体基因 ,并分析其在COS 7细胞中的表达。方法 :以从噬菌体抗体库中筛选的抗HBsAg的Fab抗体基因为模板 ,分别扩增其轻、重链可变区 (VL、VH)基因 ,通过重组PCR方法将轻、重链可变区基因用连接肽(Gly4Ser) 3的编码序列连接 ,并引入前导肽编码序列 ,构建具有L VH Linker VL 结构的单链抗体基因。将所构建的单链抗体基因克隆入绿色荧光蛋白 (GFP)融合表达载体pEGFP N3,并转染COS 7细胞进行表达。结果 :经测序表明 ,前导肽、连接肽、VL 及VH 的序列正确。酶切鉴定证实 ,成功地构建了GFP基因融合表达载体。瞬时转染COS 7细胞后 ,通过荧光显微镜观察证实有ScFv融合蛋白的表达。转染细胞的培养上清浓缩后 ,进行SDS PAGE及Westernblot分析 ,可检出ScFv融合蛋白的分泌性表达。培养上清的间接ELISA检测证实 ,所表达的单链抗体具有与HBsAg结合的特异性。结论 :成功地构建了抗人HBsAg单链抗体基因 ,并可在COS

抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的 利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法 从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果 构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论 经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。

优化重叠PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变

利用重叠PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点，国内外文献未见其方法学的系统报道。以不同VH、VL和Linker基因为拼接模板进行重叠PCR，针对影响重叠PCR扩增的拼接类型，引物设计，反应条件等进行优化。结果表明两段重叠连接比三段更容易实现，且扩增效果好；引物的互补序列长度一般应大于15bp，且在18—24bp时扩增效果最好；退火温度在52—600C，Mg^2＋浓度在1．5—2．5mM时对拼接的效果影响较小；直接或间接使用拼接模板均可以实现重叠PCR的扩增。利用优化策略，首次构建了抗除虫菊酯的scFv基因文库并引入抗XAC糖蛋白scFv基因的点突变，为除虫菊酯抗体文库构建和抗XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础。

SOE-PCR法合成狂犬病毒单链抗体基因Fv57

目的:通过一系列短引物拼接合成狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57。方法:采用SOE-PCR的方法,利用多条短的寡核苷酸引物,经过6轮PCR,拼接合成800bp左右的狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,并利用此方法修正了上述PCR过程中产生的多处突变,从而获得正确的单链抗体基因序列。结果:采用SOE-PCR法合成的基因序列经测序及酶切鉴定,与预期结果一致。结论:成功地利用SOE-PCR法合成了狂犬病毒糖蛋白单链抗体基因Fv57,为其下一步构建原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达奠定基础。

抗人RBC A抗原50A株单抗可变区基因克隆及单链抗体基因构建

目的：从分子水平分析抗人红细胞血型Ａ抗原单克隆抗体５０Ａ株，进而为制备新一代基因工程抗体的血型检定试剂奠定基础。方法：从杂交瘤细胞提取总ＲＮＡ，经ＲＴ－ＰＣＲ扩增、克隆抗体的轻、重链可变区基因，用ＰＣＲ及双脱氧核苷酸链终止法分析其核苷酸序列，采用ＰＣＲ技术重叠延伸拼接法构建５０Ａ单抗单链抗体基因。结果：序列分析表明所克隆基因为抗体轻、重链可变区基因，５０ＡＶＨ隶属于小鼠Ｉｇ重链ⅡＢ亚组，是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３基因重排产生；５０ＡＶＬ隶属于小鼠ＩｇＫａｐｐａ链Ⅱ亚组，Ｊｋ１基因重排。重叠延伸拼接法构建单链抗体基因简易可行。结论：所克隆基因含有正确的抗体框架结构，可作为研究基因工程血型检定抗体的目标基因。

抗ICAM-1单链抗体基因的克隆及序列分析

应用 RT- PCR技术 ,从分泌具有中和活性的抗 ICAM- 1单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞 F12中 ,扩增出抗体VH和 VL 基因 ,用 linker(Gly4 Ser) 3基因 ,将 VH和 VL 基因连接成 Sc Fv基因 ,并将其克隆到 p MD18- T载体中。经核苷酸序列分析证实 ,VH、VL 基因和 linker基因拼接正确 ,基因全长为 74 4 bp。经计算机分析 ,VH 和 VL 基因均为新发现的基因序列 ,符合功能性重排鼠抗体可变区基因特征。 VH和 VL 基因分别属于鼠免疫球蛋白重链 (B)和轻链к

鼠抗人转铁蛋白单链抗体基因的表达

目的 制备抗人转铁蛋白单链抗体。方法 拼装好并带有酶切位点粘性末端的鼠抗人转铁蛋白的单链抗体基因经凝胶电泳定量后,同载体pCANTAB 5E连接,以其转化E.coli TG1细胞,经辅助噬菌体M13K07挽救构建噬菌体抗体表面呈现文库、抗原包被固相材料富集选择阳性重组噬菌体克隆（Panning）。感染能产生可溶抗体片段的大肠杆菌菌株E.coli HB2151,制备可溶抗体,以Anti-E末端抗体进行Western blot、ELISA检验和分子量测定。结果 人转铁蛋白的单链抗体基因成功表达。结论 用基因工程抗体技术制备抗体是可行的。

重症肌无力单链抗体基因的制备

[目的 ]构建抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体 .[方法 ]应用多聚酶链反应从抗人乙酰胆碱受体主要免疫原区抗原结合片段扩增重链和轻链可变区基因 ,并克隆到载体噬粒 pHEN2 .将含有单链抗体基因的重组噬粒转化大肠杆菌DH5α ,分离提纯重组噬粒后再经酶切、琼脂糖凝胶电泳检查以确认单链抗体基因的正确性 .[结果 ]电泳检查发现了大小分别为 3 78bp ,3 3 9bp和 762bp的重链可变区、轻链可变区和单链抗体基因 ,且位置正确 .[结论

抗人红细胞单链抗体基因的构建及表达

从分泌抗人红细胞单克隆抗体的杂交瘤细胞 3F5中提取总 RNA,逆转录成 c DNA,用合成的寡核苷酸引物通过 PCR扩增和克隆单抗的轻、重链可变区基因 ,用双脱氧核苷酸链终止法分析核苷酸序列 ,采用 PCR拼接法构建单链抗体基因 ,并插入原核表达载体 PEt- 2 8a,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经 IPTG诱导后表达 .序列分析表明所克隆的 VL、VH分别属于鼠 Ig Kappa轻链 IV亚组和 Ig重链 亚组 .VH、VL基因均含正确的框架结构 ,构建的单链抗体基因全长 750 bp,在原核系统中的表达产物经 SDS- PAGE分析相对分子量约为 2 80 0 0 .

抗人VEGF单链抗体基因的克隆及突变校正

目的:回复基因克隆过程中的异常点突变,重新表达抗人血管内皮生长因子(VEGF)单链抗体基因(V11),恢复其抗原结合能力。方法:通过逆转录及多聚酶链式反应(RT-PCR),扩增抗人VEGF单克隆抗体(E11)的可变区基因片段,构建表达载体pET-15b(含E-tag)。将V11轻、重链可变区基因序列(V11L、V11H)与其所属亚组共同序列和一致序列进行联配比较,发现异常氨基酸并分析其性质,确定异常突变点。PCR定点回复突变,重新表达单链抗体基因(V11m),ELISA检测表达产物与VEGF165的结合。结果:V11存在四个异常突变点:V11L第7、23、36位,V11H第113位。回复突变后的表达产物与VEGF165的结合能力显著提高。结论:利用抗体残基位置序列保守性及氨基酸侧链性质分析,可以推定并有助于回复异常点突变,该方法简便易行。获得的抗人VEGF单链抗体对恶性肿瘤的诊治具有潜在的应用价值。

抗HBV Pres2单链抗体基因的构建、克隆、表达及鉴定

3B9是一株分泌HBV Pres2抗原的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系。为了构建基因工程抗体并从分子水平分析3B9株McAb,我们用分子生物学技术提取3B9杂交瘤细胞总RNA,经反转录和聚合酶链式反应(PCR)技术分离获得了3B9McAb的轻、重链可变区基因(VL/VH)。

鼠源单抗3G1单链抗体基因的构建及序列分析

利用RT PCR方法 ,从分泌抗汉滩病毒mAb的杂交瘤细胞系 3G1中扩增出抗体VH 和VL基因 ,通过PCR方法获得linker VL 基因 ,进而利用加端PCR技术 ,在扩增出的单抗体VH 和linker VL基因两端加上限制性酶切位点 ,分别克隆入 pUC18中并测序 .3G1VH 基因长 36 0bp ,编码 12 0个氨基酸 ;VL 基因长 32 4bp ,编码 10 8个氨基酸 .在pUC18载体中将VH 和linker VL 基因连接成ScFv基因 .

绿脓杆菌外毒素A单链抗体基因的制备及其克隆的研究

为制备中和活性较高的单抗细胞2F6的单链抗体(ScFv)基因,以绿脓杆菌外毒素A(PEA)类毒素为免疫原,用单克隆抗体技术制备可分泌具有中和活力单克隆抗体的杂交瘤细胞,再应用RT-PCR从其中一株杂交瘤细胞中扩增出抗体V_H和V_L基因,用Linker(G4S)3将V_H和V_L基因连接成ScFv基因,并将其克隆至pGEM-T载体中。经核酸序列分析证实,V_H、V_L和Linker基因连接正确,基因全长729bp。经计算机分析V_H、V_L基因符合功能性重排的鼠抗体可变区基因的特征。V_H和V_L基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ(A)和轻链κⅥ家簇。

利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒单链抗体基因

目的：利用核糖体展示技术筛选口蹄疫病毒特异性单链抗体基因。方法：在己构建好的核糖体展示文库的基础上，利用核糖体展示技术，经过5轮的体外转录、体外转译、亲和筛选和RT－PCR，将得到的序列进行测序分析。结果：筛选到FMDV scFv基因，且基因得到富集。结论：实验运用核糖体展示技术，以FMDV抗原和纯化的146S病毒粒子为靶标筛选到了FMDV scFv基因，将为scFv用于FMD的基础研究、免疫学研究以及为预防、治疗和诊断提供帮助，也为研制FMD的快速诊断技术奠定先前基础。

胃癌相关的人源单链抗体基因文库的构建

目的 构建胃癌相关的人源单链抗体基因文库。方法 应用DNA重组技术 ,从胃癌患者的转移淋巴结及其脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体 (ScFv)cDNA文库。将cDNA文库克隆到噬菌粒载体 pCANTAB5 ,并转化大肠杆菌TG 1。随机对所得细菌克隆进行序列分析。结果 cDNA文库克隆到噬菌粒载体pCANTAB5后转化大肠杆菌TG 1,得到 2 .5× 10 7个氨苄青霉素菌落。ScFv序列分析结果证实VH 属于人源抗体VHⅢ亚群 ,VL 属于VκⅢ亚群。

抗膀胱癌单链抗体基因在烟草中的表达

以抗膀胱癌单链抗体(scFv)基因为目的基因,构建植物表达载体,转化烟草,研究医用治疗性工程抗体基因在植物中的表达.结果表明,经Southern杂交鉴定出的转基因植株,叶片提取物的蛋白电泳有特异带出现,其分子量约为27 ku,同预期的单链抗体分子量一致,表达量最高的一株,抗体含量占可溶性蛋白的1.4％.竞争性抑制ELISA测定结果显示,该抗体有抗原结合活性.

抗牛精子sp18蛋白单链抗体基因的克隆及表达

应用重组噬菌体抗体技术，从小鼠抗牛精子sp18蛋白的A5杂交瘤细胞系中分离总RNA，构建重组噬菌体抗体库。以牛精子作为包被抗原，经过三轮“亲和吸附-洗脱-扩增”淘选后，用phage-ELISA筛选出特异性阳性克隆。取其中特异结合牛精子细胞的重组噬菌体抗体pCSA1克隆进行序列测定。将其ScFv(single chain fragment variable)因克隆到pET-30a(+)上，用IPTG进行诱导表达，成功得到了抗sp18单链抗体基因蛋白。

抗人脂蛋白(a)单链抗体基因的克隆和表达

目的 构建鼠抗人脂蛋白 [Lp(a) ]单链抗体 (ScFv)基因。方法 在克隆抗人Lp(a)抗体VH和VL 基因的基础上 ,设计并合成了PCR引物。两个外测引物分别含有EcoRl和Sali酶切位点及起始码和终止码序列 ,4个内侧引物各含部分连接肽基因序列。采用限制性内切酶酶切拼接法 ,并按VH Linker VL的结构将轻、重链可变区基因拼接单链抗体基因。结果 拼接成的ScFv长度约为 730bp。结论 所构建的为功能性抗Lp(a)

从噬菌体抗体库克隆抗人RBC单链抗体基因

目的用噬菌体抗体库技术克隆抗人红细胞（ＲＢＣ）的单链抗体（ＳｃＦｖ）基因。方法以人ＲＢＣ免疫小鼠，取脾细胞，ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＶＨ和Ｖκ基因，组装到ＳｃＦｖ－噬菌体抗体表达载体中，构建了噬菌体抗体库，以人ＲＢＣ为固相抗原，对该库进行了四轮“吸附－洗脱－扩增”筛选，获得了抗人ＲＢＣ的ＳｃＦｖ基因。结果ＤＮＡ序列分析表明其可变区基因分别属于小鼠ＶＨⅢ亚群和ＶκⅤ亚群。结论所表达的ＳｃＦｖ可与不同人ＲＢＣ结合，与ＡＢＯ血型抗原无关。

人红细胞单链抗体基因的克隆及其序列分析

目的：获得抗人红细胞的单链抗体基因。方法：以分泌抗人红细胞单抗（ＨＲＣ）的杂交瘤细胞总ＲＮＡ为模板，分别扩增出轻链可变区（ＶＬ）和重链可变区（ＶＨ）基因，用连接肽将其连接成具ＶＬ－ｌｉｎｋｅｒ－ＶＨ结构的单链抗体基因。结果：ＤＮＡ序列分析证实，获得的单链抗体基因的轻、重链分别属于鼠Ｉｇｋａｐｐａ轻链第Ⅲ亚组和Ｉｇ重链第Ⅱｃ亚组。结论：构建的抗人红细胞单链抗体的载体，提供了与其他基因连接，为建立病人自身血细胞凝集实验奠定了基础。