特异性结合革兰氏阴性菌外膜蛋白C的单链抗体核糖体展示文库的构建

以纯化的重组大肠杆菌外膜蛋白Omp C免疫BALB/c小鼠,提取骨髓浆细胞总RNA,逆转录获得c DNA,作为模板通过PCR扩增获得重链和轻链可变区序列。由(Gly4Ser)3 linker连接两片段,获得单链抗体可变区片段基因库。重叠延伸PCR添加T7启动子、核糖体结合位点、gⅢtether和两端茎环结构等元件,成功构建对外膜蛋白C具有特异性亲和力的单链抗体可变区的核糖体展示文库,为特异性强、亲和力高的单链抗体可变区筛选提供了技术和材料基础。构建能与革兰氏阴性菌外膜蛋白C特异性结合的鼠源单链抗体核糖体展示文库,是奠定构建饲料革兰氏阴性腐败菌分子预警和靶向抗菌剂的靶向定位区的高亲和力单链抗体可变区片段的重要基础,对建立有害革兰氏阴性菌分子检测方法和靶向抗革兰氏阴性菌菌剂设计方法具有借鉴作用。

全人源抗IL-33scFv-IgG1Fc融合蛋白在CHO k1细胞中稳定高表达

目的利用两种不同真核表达载体构建全人源抗白细胞介素33单链抗体c片段(IL-33 sc Fv-Fc)重组载体,转染中国仓鼠卵巢(CHO)k1细胞,筛选稳定高表达单细胞株以提高融合蛋白产量。方法双酶切前期构建的重组质粒pc DNA3.1/SPsc Fv-Fc,回收SP-sc Fv-Fc片段,插入载体PMH3EN中,构建PMH3EN/SP-sc Fv-Fc重组载体并与重组质粒pc DNA3.1/SP-sc Fv-Fc分别转染CHO k1细胞;反转录PCR、Western blot法检测目的基因sc Fv-Fc的转录及表达;Dot blot法筛选稳定高表达细胞株;ELISA检测sc Fv-Fc的水平及生物学活性。结果重组质粒测序结果表明成功构建了真核表达载体PMH3EN/SP-sc Fv-Fc,插入目的基因SP-sc Fv-Fc大小为1560 bp左右。反转录PCR检测重组质粒表达情况显示两组重组质粒的目的基因在CHO k1细胞中均成功转录。sc Fv-Fc不仅可分泌到细胞培养基中,还可与人IL-33以及抗人Ig G1 Fc特异性结合。重组载体PMH3EN/SP-sc Fv-Fc组融合蛋白表达水平相对较高。经过4轮筛选,选出了稳定高表达细胞株,初步测其sc Fv-Fc表达产量为10 mg/L;竞争ELISA检测结果显示sc Fv-Fc可显著抑制IL-33与其受体ST2的结合。结论在CHO k1细胞成功高表达IL-33 sc Fv-Fc。