单链构象多态性分析技术检测结核杆菌利福平耐药基因

目的 :研究本地区临床分离结核杆菌rpoB基因突变与利福平 (RFP)耐药性的关系。 方法 :对 3 6株RFP敏感株和 44株RFP耐药株rpoB基因的 3 2 8bp的PCR扩增产物进行单链构象多态性 (Single strandcomformationpoly morphism ,SSCP)分析。 结果 :3 6株RFP敏感株的SSCP带谱均与参考株H 3 7Rv相同 ,44株RFP耐药株中 ,2 5株高度RFP耐药株和 11株低度RFP耐药株的SSCP带谱与H 3 7Rv带谱有差异 ;另 8株低度RFP耐药株的SSCP带谱与H3 7Rv带谱相同。结论 :SSCP分析可检测出rpoB基因突变 ,该基因突变与本地区临床分离结核杆菌对RFP耐药有关。

毛细管电泳-单链构象多态性分析检测K-ras基因突变

K ras癌基因的点突变在结直肠癌的发生起重要作用。以异丙醇为聚合反应链转移剂,水相法合成 特性粘度为0.70×10-3m3/kg,分子量为6.5×104的低粘度短链线性聚丙烯酰胺。以6%线性聚丙烯酰胺为 筛分介质,分离温度27℃,分离电压9kV为电泳条件,建立了检测K ras基因突变的毛细管电泳 单链构象多 态性方法。利用该方法检测36例结直肠癌患者肿瘤组织,发现12例K ras基因突变。结果表明:该方法具有 快速、高灵敏的优点,为大规模进行结直肠肿瘤的早期诊断提供了可靠方法。

变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性分析检测皮肤癌p53基因突变的比较

目的 检测皮肤癌 p5 3基因 5～ 8外显子的突变频率 ,比较变性梯度凝胶电泳 (DGGE)和单链构象多态性分析 (SSCP)检测p5 3基因突变的敏感性。方法 分别采用DGGE和SSCP ,对 40例皮肤癌患者手术切除组织的 p5 3基因 5～ 8外显子进行突变检测。 结果 皮肤癌 p5 3基因 5～ 8外显子的总突变率为 35 % ,其中鳞状细胞癌 (SCC)的突变率为 36 % ,基底细胞癌 (BCC)为 33%。采用DGGE和SSCP检测的突变率分别为 33%和 2 5 %。结论 35 %的皮肤癌组织存在 p5 3基因 5～ 8外显子突变。DGGE检测p5 3基因突变的敏感性高于SSCP。

DNA单链二级结构预测与单链构象多态性分析的一致性研究

单链构象多态性 (SSCP)分析是一种简便 ,快速检测DNA突变的方法 ,它在基因突变检测、遗传分析、进化研究等领域有着广泛的应用价值 .但是这种方法的突变检出率随DNA序列不同而变化 ,一般只能达到 70 %～ 80 % .这主要是有的碱基突变对单链DNA的构象影响较小 ,不能通过SSCP检测出来 .将计算机对DNA二级结构的预测结果和实验结果作了对比 ,发现二者有很高的一致性 .这一结果表明计算机的DNA单链二级结构预测分析可用于PCR SSCP分析的辅助设计 。

变性梯度凝胶电泳和单链构象多态性分析检测肺癌p53基因8号外显子突变

目的：检测ｐ５３基因８号外显子突变。方法：分别采用变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）和单链构象多态性分析（ＳＳＣＰ），对３５例肺癌病人手术切除组织的ｐ５３基因８号外显子（Ｅｘｏｎ８）进行突变检测。结果：采用ＤＧＧＥ检测的突变率为２０％，而ＳＳＣＰ检测的突变率为１１％。ｐ５３基因Ｅｘｏｎ８的总突变率为２３％。结论：ＤＧＧＥ检测ｐ５３基因突变的敏感性高于ＳＳＣＰ。

聚合酶链反应-单链构象多态性分析在家族性高胆固醇血症研究中的应用

目的：探讨聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ－ｓｉｎｇｌｅｓｔｒａｎｄｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）在家族性高胆固醇血症（ｆａｍｉｌｉａｌｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ，ＦＨ）研究中的应用价值。方法：提取ＦＨ患者外周血基因组ＤＮＡ，进行ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及ＤＮＡ序列分析。结果：对１家２例临床诊断为ＦＨ的患儿及其父母从基因水平明确了诊断。ＬＤＬ受体基因突变是位于第６外显子的移框突变。结论：ＰＣＲ－ＳＳＣＰ可以从基因水平对ＦＨ患者明确诊断，并可对先证者家系成员早期诊断，以便提供咨询和指导。

用聚合酶链反应单链构象多态性分析技术检测结核分枝杆菌L型的rpoB基因突变

目的:探索结核分枝杆菌L型的耐药基因rpoB突变与利福平耐药性的关系,以及聚合酶链反应单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术的临床应用价值。方法:收集结核分枝杆菌L型菌株52株,采用PCR-SSCP方法检测rpoB基因,与采用常规药敏试验法检测利福平耐药的结果进行对比分析。结果:采用常规法检测,52株临床分离株中有38株利福平耐药,耐药率为73.08%(38/52);PCR-SSCP方法对52株临床耐药株rpoB基因突变的检出率为65.38%(32/52),两种方法检测耐利福平的符合率为84.21%。结论:PCR-SSCP对利福平耐药的结核分枝杆菌L型菌株检出率较高,将其与常规药敏试验联合应用,是一种指导临床用药的好方法。

异源双链分析和单链构象多态性分析在基因突变检测中的作用

目的 :评价异源双链分析 (HET)和单链构象多态性分析 (SSCP)在基因突变检测中的作用。方法 :同时应用两种方法检测 2 3例肺腺癌标本中 p53基因和 p16基因突变情况。 结果 :用HET法检出 6例p53基因突变和 5例 p16基因突变 ,用SSCP法检出 3例 p53基因突变和 1例 p16基因突变 ,联合应用HET和SSCP方法检出 7例 p53基因突变和 5例 p16基因突变。 结论 :检测基因突变HET优于SSCP ,联合应用HET和SSCP能提高基因突变检出率。

猪品种ESR和PRLR基因的PCR-SSCP多态性分析

采用聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)方法,对国外引进猪品种杜洛克猪、长白猪、大约克夏猪和东北地方猪品种东北民猪、丹东黑猪共计305头母猪进行了雌激素受体基因(Estrogen receptor gene,ESR)和催乳素受体基因(Prolactin receptor gene,PRLR)的多态性检测,并对其遗传多样性进行了分析。结果表明,两个基因位点在5个猪品种中均存在着多态性,5个猪品种的ESR基因和PRLR基因位点的期望杂合度分别在0.2581～0.4967和0.4007～0.4885,多态性信息含量分别在0.2248～0.3734和0.3204～0.3692。各个猪品种均表现出了中度的多态性。

聚合酶链式反应偶联单链构象多态性分析(PCR-SSCP)技术用于鹿鞭线粒体DNA指纹的研究

目的建立一种快速、简便、准确的分子生物学方法,用来鉴别鹿鞭真伪及品种。方法应用柱色谱法提取梅花鹿鞭、马鹿鞭、牛鞭以及市售鹿鞭线粒体DNA;根据GenBank中鹿类动物线粒体细胞色素b基因序列,设计一对引物用于线粒体DNA的聚合酶链式反应(PCR)特异性扩增;应用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对聚合酶链式反应产物进行单链构象多态分析(single strand conformation polymorphism,SSCP)。结果梅花鹿鞭、马鹿鞭以及部分市售鹿鞭可显示清晰且迁移率不同的片段;对照组伪品鹿鞭及部分市售鹿鞭无特异性显示。结论柱色谱法提取线粒体DNA所需时间短,DNA纯度高,DNA分子的破坏性较小,为特异性聚合酶链式反应扩增提供一级结构保证;单链构象多态分析法可以清晰显示正品梅花鹿鞭、马鹿鞭以及部分市售鹿鞭单链片段,其一级结构中的碱基差别为正品梅花鹿鞭、马鹿鞭的不同迁移率提供依据,也为药源市场鹿鞭的鉴别提供一种可以直接进行亚种间鉴别的快速、简便、准确的可行性方法。

猪源沙门氏菌氟喹诺酮耐药基因突变的SSCP分析

应用PCR扩增猪源沙门氏菌GyrA基因的喹诺酮耐药决定区,并对扩增产物进行SSCP分析,比较SSCP图谱与耐药性之间的相关性。同时对GyrA基因扩增产物进行测序,分析氨基酸的变异情况。结果显示,猪源沙门菌GyrA基因的喹诺酮耐药决定区PCR扩增产物的大小为317 bp,敏感菌株与标准菌株SSCP图谱相一致,耐药菌株与标准菌株的SSCP图谱差异明显,GyrA基因QRDR的突变位于第83和87位氨基酸位点。通过SSCP可早期、准确、快速地检测出猪源沙门氏菌是否对氟喹诺酮耐药。

弓首蛔虫和狮弓蛔虫线粒体nad1基因部分序列多态性研究

【目的】对弓首属犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫、马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓属狮弓蛔虫线粒体DNA(mtDNA)中烟酰胺脱氢酶亚基I(nad1)基因部分序列(pnad1)进行比较研究,分析它们之间的序列差异和种群遗传关系。【方法】先用同位素(γ33P)标记上下游引物,通过PCR方法扩增出单个虫体线粒体pnad1片段,然后采用单链构象多态性(SSCP)分析技术对pnad1片段进行多态性研究,最后挑选出代表性样品进行测序,并利用基因分析软件DNAStar(版本5.01)对序列进行分析比较。【结果】犬弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0.3%～1.9%,与猫弓首蛔虫、马来亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别为11.0%～14.1%、10.7%～12.4%、12.6%～13.7%和17.5%～18.2%。猫弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为2.8%,与马来西亚弓首蛔虫、牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12.0%～13.0%、15.1%和18.6%～21.2%。马来西亚弓首蛔虫种内pnad1基因序列差异为0～0.3%,与牛弓首蛔虫和狮弓蛔虫的种间序列差异分别是12.4%～12.8%和18.6%～19.0%。【结论】犬弓首蛔虫、猫弓首蛔虫和马来西亚弓首蛔虫不同地方虫株的pnad1序列都有一定差异(0～2.8%)。但种间pnad1的序列差异(10.7%～21.2%)明显高于种内的序列差异,说明nad1基因可以作为弓首蛔虫和狮弓蛔虫分子分类及种群遗传关系研究的遗传标记。

多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测耐异烟肼结核分枝杆菌

目的 建立耐异烟肼 (isoniazid ,INH )结核分枝杆菌多重聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (multiple polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,multi PCR SSCP)方法 ,快速、特异地同时检出aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况 ,用于快速诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性。方法 根据结核分枝杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列 ,分别设计出 3对特异性寡聚核苷酸引物 ,采用multi PCR及SSCP技术 ,同时检测对结核分枝杆菌耐INH起作用的这 3个基因的突变情况。结果 对H3 7Rv标准株、临床分离INH敏感株 (2 3株 )及INH耐药株 (3 5株 )分别采用常规PCR和multi PCR同时进行扩增 ,两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段 ,且结果符合率达10 0 % ;采用单基因PCR SSCP ,aphC启动子序列突变检出率 17% (6/3 5)、inhA序列突变检出率 2 0 % (7/3 5)、katG序列突变检出率 66% (2 3 /3 5) ;multi PCR SSCP突变检出率 83 % (2 9/3 5)。结论 耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,multi PCR SSCP方法敏感、特异 ,能同时快速有效地检测结核分枝杆菌aphC启动子、inhA、katG 3个INH耐药基因的突变 ,提高检验效率 ,有望成为临床指导用药的好方法。

扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元的克隆及序列分析

3头扬子鳄血样取自宣城安徽省扬子鳄繁殖研究中心。利用一对简并引物对MHCⅡ类B基因第二外元的部分片段进行扩增 ;通过克隆、单链构象多态性分析、测序 ,并将测得序列与下载的 8个物种MHC序列比对 ,确定序列差异和变异位点 ;利用MEGA软件构建NJ树 ,PAUP4 0构建MP树。结果得到 10种不同的序列 ,片段长 16 6bp。核苷酸序列中有 38个变异位点 ,氨基酸序列中有 2 3个变异位点 ;推定的抗原结合位点非同义替换 (dN)明显高于同义替换 (dS)。 10种序列的NJ树和MP树极为相似 ,均为A、B两个分支 ,两个分支明显的特异性位点核苷酸序列中有 9个 ,氨基酸序列中有 7个。表明扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元有较高的多态性 ,有利于扬子鳄饲养种群的遗传保护。

白假丝酵母菌基因型和假丝酵母菌群分布与外阴阴道假丝酵母菌病严重程度的相关性分析(英文)

探讨致病假丝酵母菌菌群分布以及白假丝酵母菌基因型与外阴阴道假丝酵母菌病症状严重程度的关系。方法我们对2009年9月~2010年10月在我院就诊的,以及生活习惯、饮食、既往用药及工作环境相似的急性VVC患者,利用聚合酶链反应-单链构象多态性分析技术（PCR-SSCP）对其阴道来源的假丝酵母菌进行分子水平的菌种鉴定,结合SSCP和基因扫描（GeneScan）对白假丝酵母菌CAI区进行多态性分析确定其基因型,对VVC的严重程度进行临床症状体征的评分。结果从获得的198份标本中分离白假丝酵母菌140株（70.7%）;58株非白假丝酵母菌（29.3%）。198名患者中重度VVC 95人,轻中度VVC 103人。白假丝酵母菌在重度VVC和轻中度VVC患者中所占比列分别为62.1%和76.6%（P=0.011）。140株C.albican共检出38种CAI基因型且集中分布于少数几种,其中基因型30-45（44株,31.43%）和32-46（23株,16.43%）最常见,其次为基因型30-46（4株,2.86%）和32-47（9株,6.42%）。以上4种优势基因型菌株在重度VVC和轻中度VVC患者中的分布差异有统计学意义（77.9%vs 42.0%,P〈0.001）。结论白假丝酵母菌仍然是VVC的主要致病菌,但非白假丝酵母菌与白假丝酵母菌相比更容易引起重度VVC,白假丝酵母菌的基因型与VVC严重程度有关。

重庆地区柑桔衰退病毒组群分析

柑桔衰退病毒(CTV)存在着许多生物学特性不同的株系。通过铲除感染强毒株植株或利用弱毒株交叉保护的方式来防治柑桔衰退病都需要对CTV株系进行准确、可靠的鉴定。根据对CTV衣壳蛋白基因(CPGs)的限制性片段长度多态性(RFLP)和单链构象多态性(SSCP)分析,发现在重庆地区CTV主要以CP/HinfⅠRFLP第1,3和6组群为主,并且在田间以多株系混合感染为主。

大肠腺瘤及癌组织APC基因突变分析

目的探讨腺瘤、大肠癌组织与APC基因突变的关系。方法41例大肠癌与腺瘤组织标本,采用银染单链构相多态性技术分析APC基因突变情况。结果35例原发性结、直肠癌组织有16例发生APC基因突变,突变率为45.7%。8例腺瘤组织检出突变3例,突变率为37.5%。APC基因在散发性大肠腺瘤与大肠癌中均有较高突变频率,两者差异无统计学意义。结果还表明,APC基因突变与年龄、性别、肿瘤性质、位置、类型、分期、淋巴结转移无关。结论APC基因突变在大肠腺瘤阶段就出现,属于大肠癌发生的早期阶段。检测APC基因突变能预测腺瘤的癌变倾向,有助于早期发现大肠癌。

子宫内膜癌组织中抑癌基因PTEN突变分析

目的 了解子宫内膜癌组织中磷酸酶基因PTEN突变情况及其与临床病理特征的关系。方法 采用聚合酶链反应 单链构象多态性方法 (PCR SSCP)对 70例子宫内膜癌组织进行PTEN基因 9个外显子的突变检测。结果 70例子宫内膜癌组织中PTEN基因突变率为 38.5 7% ( 2 7/70 ) ,突变较多地分布在第 5、7、8号外显子上 ;子宫内膜样癌突变率 ( 4 4.8% )明显高于浆液性和粘液性腺癌 ( 8.3% ) ,P <0 .0 5 ,G 1级、G 2级、G 3级的突变率分别为 5 3.3%、45 .5 %、18.2 % (P <0 .0 5 ) ,Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的突变率分别为 5 2 .4%、2 8.6 %、14 .3% (P <0 .0 5 ) ,肌层浸润程度越深 ,突变率越低 (P <0 .0 5 )。结论 PTEN基因突变是子宫内膜癌发生的早期事件 ,并与预后良好的临床病理特点相关。