ApNPV编码的DNA单链结合蛋白基因lef-3的克隆与分析

用随机克隆法,克隆得到了柞蚕核型多角体病毒(Antheraeapernyinucleopolyhedrovirus,ApNPV)PstⅠ和XhoⅠ片段,经序列分析表明,该片段含有完整的晚期表达因子3(lef3),与其它来源的lef3基因具有很高的同源性。ApNPVlef3基因的阅读框为1110bp,编码369个氨基酸,编码一种DNA单链结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)。lef3基因参与病毒DNA复制,是病毒DNA复制必不可少的蛋白质因子。LEF3的N-端有一个氨基酸保守序列区,推测此氨基酸序列保守区是LEF3的主要功能区。在lef3基因上游的互补序列有一编码127个氨基酸序列的不完全阅读框,根据同源性比较,此阅读框与黄杉毒蛾核型多角体病毒(Orgyiapseudotsugatanucleopolyhedrovirus,OpNPV)的ORFs73编码相似的基因,而在该片段的3′端其序列与近缘种OpNPV和云杉卷叶蛾多角体病毒(Choristoneurafumiferananucleopolyhedrovirus,CfNPV)没有同缘性,显示了ApNPV基因组结构有其固有的特点。

单分子动力学研究大肠杆菌单链结合蛋白与单链DNA的结合过程

大肠杆菌单链结合蛋白(E.coli SSB)具有与单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA)结合的性质,起着保护ssDNA及引导相关蛋白质反应的重要作用,然而,它与ssDNA的结合过程及其细节尚未得到确定的研究结果.本文采用单分子磁镊对E.coli SSB/ssDNA复合体进行拉力测试,并采用单分子化学反应动力学方法对测试结果进行分析.研究发现:E.coli SSB在ssDNA上的结合过程分为两个不同的阶段,一个是在临界力下快速的结合缠绕阶段,一个是随着力的进一步减小逐步缠绕的阶段.从中得到了E.coli SSB与ssDNA的化学反应系数,并得到了相应的自由能参数.采用自由能校准的方法,得到了SSB与ssDNA结合的完整自由能曲线,从而揭示了E.coli SSB与ssDNA的结合特征.本文的分析方法也可以应用于相似的化学反应的研究中.

人线粒体单链DNA结合蛋白1在恶性肿瘤发生、发展中的作用及研究进展

人线粒体单链DNA结合蛋白1(mitochondrial single-strand DNA-binding protein 1, mtSSBP1)是定位于线粒体中的单链DNA结合蛋白,参与线粒体DNA(mtDNA)的复制、转录和修复,在维持线粒体基因组的稳定性和功能等发挥重要作用。mtSSBP1与肿瘤细胞增殖、转移和侵袭等恶性生物学行为相关,在多种人类恶性肿瘤中表达上调,其与肿瘤组织浸润加深、分化能力减弱、肿瘤增大和临床分期增加均相关。该文现对mtSSBP1的结构、功能及其在不同类型恶性肿瘤中的作用机制进行阐述,旨在为mtSSBP1与肿瘤的基础研究和临床应用提供参考。

单纯疱疹病毒1型单链结合蛋白ICP8研究进展

在单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus 1,HSV⁃1)中,感染细胞蛋白8(Infected cell protein 8,ICP8)是由UL29基因编码的一种单链DNA结合蛋白(Single strand DNA⁃binding protein,SSBP),该蛋白在病毒复制中必不可缺,具有维持单链DNA的稳定性,并与其他病毒蛋白相互结合,促进病毒复制室的形成,介导晚期基因的表达。除此之外,ICP8还具有促进UL9编码的起源结合蛋白(Origin binding protein,OBP)和UL5/UL8/UL52蛋白的酶活性,与UL12蛋白共同介导链交换等功能。本文就上述目前国内外对HSV⁃1 ICP8的研究进展作一综述,以期为后续研究ICP8的作用机制提供参考。

重组大肠杆菌单链结合蛋白性质表征及其在提高焦磷酸测序准确性中的应用

利用基因工程手段表达了分子量约为24 kDa的重组大肠杆菌单链结合蛋白(r-SSBP),通过凝胶阻滞电泳与DNA熔解温度(Tm)影响实验表征了r-SSBP与单链DNA(ssDNA)结合的特性,结果表明,r-SSBP可以与ssDNA结合,并且能够降低DNA的Tm值,同时还能增大含有单个错配碱基的DNA与完全匹配的DNA的Tm值差异,这一特性在提高单核苷酸多态性检测的特异性方面具有潜在的应用价值。此外,将r-SSBP应用于本课题组开发的高灵敏度焦磷酸测序体系中测定已知序列ssDNA模板,结果表明,r-SSBP能够有效降低非特异信号,改善信号峰比例,提高焦测序的准确度,为完善高灵敏度焦磷酸测序体系奠定了基础。

动力学毛细管电泳法求解蛋白质与单链脱氧核糖核苷酸结合的解离常数及可靠性分析

平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)可用于测定复合物的解离常数(K_d)。该文以单链脱氧核糖核苷酸结合蛋白(SSB)和单链脱氧核糖核苷酸(ssDNA)相互作用为模型,分析了相互作用强弱的电泳图谱特征,测定了不同条件下复合物的K_d,建立了基于积分偏差的误差分析方法。结果表明,SSB与ssDNA相互作用强弱所致的电泳图差异、SSB与ssDNA的浓度比、毛细管分离温度均影响K_d的计算。此外,基于25℃时SSB与5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′(15mer)人凝血酶适配体作用模型的数值分析结果表明,在现有实验条件下,手动积分峰面积时产生的面积偏差对K_d计算结果有影响,但在10%的偏差区间内,所求K_d值的最大相对偏差小于7%,所求K_d值的误差可忽略。该文证实了基于NECEEM求解动力学相关参数的方法可靠。

RNA结合基序单链相互作用蛋白3在人乳头瘤病毒16型相关宫颈癌细胞和鳞状细胞癌组织中的表达

目的探讨RNA结合基序单链相互作用蛋白3(RBMS3)在人乳头瘤病毒16型(HPV16)相关宫颈癌细胞和鳞状细胞癌组织中的表达。方法通过Western blotting方法检测RBMS3在HPV16 E7表达阳性和阴性宫颈癌细胞中的表达,通过免疫组织化学(IHC)染色方法检测RBMS3在HPV16 E7表达阳性和阴性宫颈鳞状细胞癌组织中的表达,并分析RBMS3和HPV16 E7表达的关系。结果 Western blotting结果显示,HPV16 E7在宫颈癌C33-A细胞中不表达,而HPV16 E7在宫颈癌Si Ha细胞中表达;C33-A细胞中RBMS3的表达显著高于Si Ha细胞(P<0.01)。IHC结果显示,RBMS3在HPV16 E7表达阳性宫颈鳞状细胞癌组织中的表达显著低于HPV16 E7表达阴性宫颈鳞状细胞癌组织(P<0.01),RBMS3和HPV16 E7表达呈负相关(P<0.01)。结论 HPV16相关宫颈鳞状细胞癌组织中RBMS3的表达与HPV16 E7的表达呈负相关,RBMS3可能与HPV16相关宫颈癌的发生有关。

植物单链DNA结合蛋白WHIRLY2研究进展

本文综述了近年来植物中WHIRLY2蛋白的研究成果,并结合研究与实践,重点阐述了WHIRLY2在调控植物叶片衰老、花粉管活力以及角果发育等方面的一些进展,以期为植物中WHIRLY2蛋白的功能研究提供依据.

单链DNA结合蛋白2对小鼠胚胎干细胞向滋养层方向分化的作用

目的寻找并鉴定可促进小鼠胚胎干细胞(ES细胞)向滋养层方向分化的新基因。方法优化小鼠ES细胞向滋养层方向分化的诱导条件,结合数据分析寻找在此分化过程中表达上调的基因,由此发现了单链DNA结合蛋白2(Ssbp2)。通过qRT-PCR检测Ssbp2在小鼠ES细胞向滋养层方向分化过程中的表达变化,并检测Ssbp2在小鼠早期胚胎对应的3种细胞类型中的表达模式。克隆Ssbp2基因并将其在小鼠ES细胞中过表达,观察细胞形态并检测其是否具有促进小鼠ES细胞向滋养层方向分化的功能。结果通过尝试不同的组合,发现在无血清的小鼠滋养层干细胞(TS细胞)基础培养液中添加BMP4联合b FGF既可诱导小鼠ES细胞中滋养层标记基因的显著上调,又可有效抑制中胚层标记基因的上调。通过表达模式分析发现,在诱导小鼠ES细胞向滋养层方向分化过程中Ssbp2的表达量发生了显著上调,并且Ssbp2在TS细胞中高表达。当在小鼠ES细胞中过表达Ssbp2之后,ES细胞发生了一定程度的分化,并且滋养层相关的标记基因发生了最为显著的上调。结论 Ssbp2具有促进小鼠ES细胞向滋养层方向分化的作用。

单链DNA结合蛋白1的研究进展

单链DNA结合蛋白(SSB)1是在人类身上新发现的一种单链DNA结合蛋白,它通过参与各种DNA损伤修复过程维持基因的完整性与稳定性。这一重大发现为各种DNA损伤修复机制提供了新的见解。本文就SSB1相关结构及功能的研究进展进行综述。

基于原子力显微镜研究固-液界面单链DNA结合蛋白纤维分形结构的形成机制

单链DNA结合蛋白(SSBP)可以在修饰了1-十六烷基硫醇单层膜的金基底(HDT/Au)上由4-氨基噻吩(4-ATP)诱导自组装形成原纤维。利用原子力显微镜对SSBP自组装形成的分形结构进行了纳米尺度表征和成像,以及结构分析。结果显示,在HDT/Au基底上,酰胺类物质可以诱导蛋白质纤维的形成,而烷基硫醇或羧基硫醇不能在HDT/Au底物上诱导蛋白质原纤维的形成。这表明正电荷酰胺与蛋白质之间的静电力为蛋白质原纤维的自组装提供了促进聚合的驱动力。酰胺类物质诱导分枝状蛋白质纤维的形成,而不是更致密的单丝紧密堆积,为发展一种全新的、空间可控的蛋白质界面自组装方法提供了依据。

基于TCGA数据库分析SSBP1基因在肝细胞癌中的表达及预后

目的利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库研究SSBP1基因在肝细胞癌(HCC)组织中的表达情况,并探讨SSBP1基因表达量与患者临床病理特征及预后的相关性。方法基于TCGA数据库提取374例HCC组织及50例正常肝组织中SSBP1基因表达量数据、患者的临床病理参数资料,利用R 4.1.2分析SSBP1在HCC中的表达情况及其与HCC患者的临床病理特征和预后的相关性,通过基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库和R 4.1.2联合分析SSBP1在HCC各临床病理分期间的表达差异,利用TIMER数据库分析SSBP1表达与免疫细胞浸润的相关性,通过R软件pROC程序包制作ROC生存曲线评估SSBP1表达量对HCC的诊断效果。结果TCGA数据库分析表明,无论是配对样本还是非配对样本,SSBP1 mRNA在HCC组织中的表达水平均高于正常肝组织(P均<0.001),且表达水平与性别和M分期有关(P均<0.05),与年龄、T分期、AJCC分期等无关(P均>0.05)。进一步进行单因素和多因素Cox回归分析发现,SSBP1高表达是影响HCC患者总生存期(OS)的独立危险因素(HR=1.713,P=0.016)。免疫细胞浸润分析发现,HCC组织中SSBP1表达与幼稚B细胞浸润水平呈负相关,而与记忆B细胞和巨噬细胞呈正相关(|r|>0.2,P均<0.05)。ROC曲线分析显示,SSBP1 mRNA表达水平对HCC的早期诊断和预后均具有良好的评估价值(AUC>0.50)。结论SSBP1 mRNA在HCC中的表达增高,且高表达是预后不良的独立危险因素,同时SSBP1对HCC具有良好的诊断价值,可成为HCC患者预后判断一种潜在的分子标志物以及免疫治疗的潜在靶点。

复制蛋白A与肝癌DNA损伤修复的研究进展

复制蛋白A是目前国内外研究细胞DNA损伤修复的热点之一。RPA是真核细胞中主要的单链结合蛋白,包含RPA1,RPA2和RPA3三个亚单位。RPA在DNA复制和修复过程中起着重要的作用。DNA复制时,RPA具有解链、结合单链模板并维持DNA连续复制的功能;DNA损伤时,RPA与具有染色体结构维持、保护、修复功能的蛋白质聚集在DNA损伤位点,共同完成对DNA损伤的检测并进行修复。因此RPA对于细胞调控DNA修复过程至关重要。目前肝癌的发生机制尚未完全阐明,但其发生与DNA的损伤积累密切相关。诱发肝癌的主要危险因素包括乙型肝炎病毒,黄曲霉毒素B1,亚硝胺等,这些诱因不仅能够引起肝细胞DNA的损伤,而且能直接或间接影响损伤修复系统,使DNA修复障碍,从而导致肝癌的发生。本文就RPA在DNA损伤修复中起到的重要作用及其肝癌DNA损伤修复的关系作一综述。

火球菌复制蛋白A的表达纯化和活性研究

将火球菌(Pyrococcus furiosus)的3个复制蛋白A相关基因pfuRPA41(PF2020),pfuRPA32(PF2018),pfuRPA14(PF2019)克隆到pDEST17质粒,并在E.coli Rosetta(DE3)表达菌株中成功表达,最终通过固定化镍离子亲和层析分别得到纯度较高的三个复制蛋白A相关蛋白,对它们的单链DNA结合活性进行了详细测试.其中单独的pfuRPA41能结合单链DNA,而单独的pfuRPA32以及pfuRPA14不能结合单链DNA;然而pfuRPA32能够促进pfuRPA41的单链DNA结合能力.同时单链DNA长度对pfuRPA41结合单链DNA的能力有显著影响;在一定长度范围内,pfuRPA41结合单链DNA能力与单链DNA长度成正比.

线粒体单链DNA结合蛋白1与恶性肿瘤相关性的研究进展

线粒体单链DNA结合蛋白1(single-strand DNA-binding protein 1,SSBP1)是一种存在于线粒体的蛋白,主要参与线粒体相关生物学活动,目前相关研究发现,其与恶性肿瘤发生发展、转移及侵袭相关。本文就SSBP1与线粒体及恶性肿瘤之间的生物相关性作一综述。

胃腺癌组织RBMS1、AKAP12表达变化及其临床意义

目的探讨胃腺癌组织RNA结合基序单链相互作用蛋白1(RBMS1)、A激酶锚定蛋白12(AKAP12)表达变化及其临床意义。方法选择胃腺癌患者102例,取手术切除的胃癌组织及其癌旁组织(距肿瘤组织边缘5 cm以上,经病理检查明确为正常胃组织),采用免疫组化法检测RBMS1、AKAP12表达。比较胃癌组织与癌旁正常组织RBMS1、AKAP12阳性表达率,采用Pearson线性相关分析法分析胃癌组织RBMS1阳性表达与AKAP12阳性表达的关系。分析胃癌组织RBMS1、AKAP12阳性表达与临床病理特征的关系以及二者表达与预后的关系。结果胃癌组织RBMS1阳性表达率显著高于癌旁正常组织,AKAP12阳性表达率显著低于癌旁正常组织(χ^(2)分别为75.583、53.204,P均<0.05)。胃癌组织RBMS1阳性表达与AKAP12阳性表达呈负相关关系(r=-0.625,P<0.05)。胃癌组织RBMS1、AKAP12阳性表达与TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05),与性别、年龄、肿瘤最大径、肿瘤部位、组织分化程度无关(P均>0.05)。所有患者术后随访2~36个月,中位随访时间25.30个月。随访期间失访1例,死亡30例,3年总体生存率为70.30%(71/101)。胃癌组织RBMS1阳性表达者与阴性表达者3年总体生存率分别为66.20%(47/71)、80.00%(24/30),胃癌组织AKAP12阳性表达者与阴性表达者3年总体生存率分别为82.14%(23/28)、65.75%(48/73)。胃癌组织RBMS1阳性表达者3年总体生存率显著低于其阴性表达者(χ^(2)=4.310,P<0.05),胃癌组织AKAP12阳性表达者3年总体生存率显著高于其阴性表达者(χ^(2)=4.569,P<0.05)。结论胃腺癌组织RBMS1高表达、AKAP12低表达,二者表达变化与肿瘤TNM分期、淋巴结转移和患者预后密切相关。

单链DNA结合蛋白1沉默对颌下腺细胞放射后增殖修复的影响

目的 研究沉默大鼠颌下腺（submandibular gland，SMG）细胞单链DNA结合蛋白1（single-strand DNA-binding protein 1，SSB1）表达后，放射损伤下细胞的增殖及修复情况。方法 机械胰酶联合法进行大鼠SMG细胞原代培养及免疫组织化学法鉴定。实验分3组：正常细胞组、阴性对照组（Ad-HK组）和实验组（Ad-SSB1-shRNA组）。重组腺病毒介导shRNA转染SMG细胞，荧光定量PCR检测SSB1表达沉默情况。CCK-8法及免疫荧光法分别检测细胞活性及γ-H2AX焦点数动态变化。结果 细胞免疫组织化学检测角蛋白和α-淀粉酶表达均呈阳性。转染72 h后转染效率接近90%，实验组SSB1 mRNA表达较正常细胞组明显降低（t=16.24，P〈0.05）。照射前，实验组细胞活性下降不明显，120 h时细胞活性才明显低于正常细胞组（t=3.29，P〈0.05）。5 Gy照射后，实验组各时间点细胞活性均明显低于阴性对照组和正常细胞组（F=10.19~30.13，P〈0.05）。γ-H2AX免疫荧光显示，沉默SSB1能抑制细胞DNA放射损伤修复。结论 沉默SSB1表达的大鼠SMG细胞对放射损伤更敏感。SSB1在大鼠SMG细胞DNA放射损伤修复中有着重要作用。

腾冲嗜热菌单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3新的单链DNA结合特性(英文)

【目的】揭示腾冲嗜热菌中两个单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3的全新的底物结合功能及其不同的体内表达模式。【方法】利用腾冲嗜热菌复制起始位点附近的长度较短的单链DNA为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot方法,研究SSB2和SSB3体外单链DNA结合特征和体内表达模式。【结果】SSB2与35nt的复制起始区单链DNA(ssDNA)结合,形成单个SSB2-DNA复合物;当与59ntssDNA结合时,可以随着蛋白浓度的递增形成一个或两个SSB2-DNA复合物;而与70nt的单链DNA结合时,则形成1～3个SSB2-DNA复合物。这些结果说明SSB2在与长度小于70nt的单链DNA结合时,存在着多种构型。而这些构型的形成取决于单链DNA的长度、蛋白的浓度,并与SSB蛋白所受的预处理温度和反应温度有关。SSB3与59nt和70nt结合时,最多形成3个或4个复合物。低温保存和高温下反应对SSB3蛋白的功能影响比SSB2更为显著,表现为构型明显减少或结合ssDNA能力下降。此外,在腾冲嗜热菌中,SSB2和SSB3的表达水平随温度变化而变化,SSB2在45℃～65℃间表达水平很高,在75℃时表达水平下降,而SSB3在45℃时表达水平较低,在55℃到75℃间表达水平较高,说明二者在腾冲嗜热菌中的表达可能受到培养温度的调控。【结论】腾冲嗜热菌中SSB2和SSB3具有全新的底物结合特征及其不同的体内表达模式。

尹玉新团队发现单链DNA结合蛋白RPA1蛋白全新的生理功能

据北京大学医学部官网消息,7月12日,北京大学基础医学院尹玉新团队在Cell Reports在线发表了题为"RPA1 Controls Chromatin Architecture and Maintains Lipid Metabolic Homeostasis"的研究论文。该论文通过构建小鼠模型,应用pull-down、RNA-seq、ATAC-seq以及Cut&tag等多组学手段发现了单链DNA结合蛋白RPA1在脂肪肝发生发展中起着重要作用。

SSBP1在肝癌组织中的表达及意义

目的观察线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)在肝癌组织的表达及意义。方法收集2013年12月至2016年12月手术切除的肝癌患者组织标本80例,采用Real time-PCR和免疫组化SP法检测80例肝癌组织和癌旁组织SSBP1 mRNA和蛋白表达状况,分析其与临床病理参数的关系,并检测SSBP1在肝癌细胞株Hep G2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7及正常人肝细胞L-02的表达状况。结果 SSBP1在肝癌组织和癌旁组织的表达水平和阳性表达率分别为1.87±0.23、0.36±0.05和80.00%(64/80)、15.00%(12/80),SSBP1在肝癌组织的表达水平和阳性表达率显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Hep G2细胞中SSBP1表达水平显著高于MHCC97H、SMMC7721、Huh7及L-02细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。且SSBP1表达与肿瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有无门静脉癌栓、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论肝癌组织和细胞系高表达SSBP1,与临床病理参数有关,且SSBP1高表达提示预后不良。