植物单链DNA结合蛋白WHIRLY2研究进展

本文综述了近年来植物中WHIRLY2蛋白的研究成果,并结合研究与实践,重点阐述了WHIRLY2在调控植物叶片衰老、花粉管活力以及角果发育等方面的一些进展,以期为植物中WHIRLY2蛋白的功能研究提供依据.

单链DNA结合蛋白2对小鼠胚胎干细胞向滋养层方向分化的作用

目的寻找并鉴定可促进小鼠胚胎干细胞(ES细胞)向滋养层方向分化的新基因。方法优化小鼠ES细胞向滋养层方向分化的诱导条件,结合数据分析寻找在此分化过程中表达上调的基因,由此发现了单链DNA结合蛋白2(Ssbp2)。通过qRT-PCR检测Ssbp2在小鼠ES细胞向滋养层方向分化过程中的表达变化,并检测Ssbp2在小鼠早期胚胎对应的3种细胞类型中的表达模式。克隆Ssbp2基因并将其在小鼠ES细胞中过表达,观察细胞形态并检测其是否具有促进小鼠ES细胞向滋养层方向分化的功能。结果通过尝试不同的组合,发现在无血清的小鼠滋养层干细胞(TS细胞)基础培养液中添加BMP4联合b FGF既可诱导小鼠ES细胞中滋养层标记基因的显著上调,又可有效抑制中胚层标记基因的上调。通过表达模式分析发现,在诱导小鼠ES细胞向滋养层方向分化过程中Ssbp2的表达量发生了显著上调,并且Ssbp2在TS细胞中高表达。当在小鼠ES细胞中过表达Ssbp2之后,ES细胞发生了一定程度的分化,并且滋养层相关的标记基因发生了最为显著的上调。结论 Ssbp2具有促进小鼠ES细胞向滋养层方向分化的作用。

基于原子力显微镜研究固-液界面单链DNA结合蛋白纤维分形结构的形成机制

单链DNA结合蛋白(SSBP)可以在修饰了1-十六烷基硫醇单层膜的金基底(HDT/Au)上由4-氨基噻吩(4-ATP)诱导自组装形成原纤维。利用原子力显微镜对SSBP自组装形成的分形结构进行了纳米尺度表征和成像,以及结构分析。结果显示,在HDT/Au基底上,酰胺类物质可以诱导蛋白质纤维的形成,而烷基硫醇或羧基硫醇不能在HDT/Au底物上诱导蛋白质原纤维的形成。这表明正电荷酰胺与蛋白质之间的静电力为蛋白质原纤维的自组装提供了促进聚合的驱动力。酰胺类物质诱导分枝状蛋白质纤维的形成,而不是更致密的单丝紧密堆积,为发展一种全新的、空间可控的蛋白质界面自组装方法提供了依据。

单链DNA结合蛋白1的研究进展

单链DNA结合蛋白(SSB)1是在人类身上新发现的一种单链DNA结合蛋白,它通过参与各种DNA损伤修复过程维持基因的完整性与稳定性。这一重大发现为各种DNA损伤修复机制提供了新的见解。本文就SSB1相关结构及功能的研究进展进行综述。

线粒体单链DNA结合蛋白1与恶性肿瘤相关性的研究进展

线粒体单链DNA结合蛋白1(single-strand DNA-binding protein 1,SSBP1)是一种存在于线粒体的蛋白,主要参与线粒体相关生物学活动,目前相关研究发现,其与恶性肿瘤发生发展、转移及侵袭相关。本文就SSBP1与线粒体及恶性肿瘤之间的生物相关性作一综述。

单链DNA结合蛋白1沉默对颌下腺细胞放射后增殖修复的影响

目的 研究沉默大鼠颌下腺（submandibular gland，SMG）细胞单链DNA结合蛋白1（single-strand DNA-binding protein 1，SSB1）表达后，放射损伤下细胞的增殖及修复情况。方法 机械胰酶联合法进行大鼠SMG细胞原代培养及免疫组织化学法鉴定。实验分3组：正常细胞组、阴性对照组（Ad-HK组）和实验组（Ad-SSB1-shRNA组）。重组腺病毒介导shRNA转染SMG细胞，荧光定量PCR检测SSB1表达沉默情况。CCK-8法及免疫荧光法分别检测细胞活性及γ-H2AX焦点数动态变化。结果 细胞免疫组织化学检测角蛋白和α-淀粉酶表达均呈阳性。转染72 h后转染效率接近90%，实验组SSB1 mRNA表达较正常细胞组明显降低（t=16.24，P〈0.05）。照射前，实验组细胞活性下降不明显，120 h时细胞活性才明显低于正常细胞组（t=3.29，P〈0.05）。5 Gy照射后，实验组各时间点细胞活性均明显低于阴性对照组和正常细胞组（F=10.19~30.13，P〈0.05）。γ-H2AX免疫荧光显示，沉默SSB1能抑制细胞DNA放射损伤修复。结论 沉默SSB1表达的大鼠SMG细胞对放射损伤更敏感。SSB1在大鼠SMG细胞DNA放射损伤修复中有着重要作用。

腾冲嗜热菌单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3新的单链DNA结合特性(英文)

【目的】揭示腾冲嗜热菌中两个单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3的全新的底物结合功能及其不同的体内表达模式。【方法】利用腾冲嗜热菌复制起始位点附近的长度较短的单链DNA为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western blot方法,研究SSB2和SSB3体外单链DNA结合特征和体内表达模式。【结果】SSB2与35nt的复制起始区单链DNA(ssDNA)结合,形成单个SSB2-DNA复合物;当与59ntssDNA结合时,可以随着蛋白浓度的递增形成一个或两个SSB2-DNA复合物;而与70nt的单链DNA结合时,则形成1～3个SSB2-DNA复合物。这些结果说明SSB2在与长度小于70nt的单链DNA结合时,存在着多种构型。而这些构型的形成取决于单链DNA的长度、蛋白的浓度,并与SSB蛋白所受的预处理温度和反应温度有关。SSB3与59nt和70nt结合时,最多形成3个或4个复合物。低温保存和高温下反应对SSB3蛋白的功能影响比SSB2更为显著,表现为构型明显减少或结合ssDNA能力下降。此外,在腾冲嗜热菌中,SSB2和SSB3的表达水平随温度变化而变化,SSB2在45℃～65℃间表达水平很高,在75℃时表达水平下降,而SSB3在45℃时表达水平较低,在55℃到75℃间表达水平较高,说明二者在腾冲嗜热菌中的表达可能受到培养温度的调控。【结论】腾冲嗜热菌中SSB2和SSB3具有全新的底物结合特征及其不同的体内表达模式。

尹玉新团队发现单链DNA结合蛋白RPA1蛋白全新的生理功能

据北京大学医学部官网消息,7月12日,北京大学基础医学院尹玉新团队在Cell Reports在线发表了题为"RPA1 Controls Chromatin Architecture and Maintains Lipid Metabolic Homeostasis"的研究论文。该论文通过构建小鼠模型,应用pull-down、RNA-seq、ATAC-seq以及Cut&tag等多组学手段发现了单链DNA结合蛋白RPA1在脂肪肝发生发展中起着重要作用。

基于TCGA数据库分析SSBP1基因在肝细胞癌中的表达及预后

目的利用癌症基因组图谱(TCGA)数据库研究SSBP1基因在肝细胞癌(HCC)组织中的表达情况,并探讨SSBP1基因表达量与患者临床病理特征及预后的相关性。方法基于TCGA数据库提取374例HCC组织及50例正常肝组织中SSBP1基因表达量数据、患者的临床病理参数资料,利用R 4.1.2分析SSBP1在HCC中的表达情况及其与HCC患者的临床病理特征和预后的相关性,通过基于基因表达水平值的交互式分析平台(GEPIA)数据库和R 4.1.2联合分析SSBP1在HCC各临床病理分期间的表达差异,利用TIMER数据库分析SSBP1表达与免疫细胞浸润的相关性,通过R软件pROC程序包制作ROC生存曲线评估SSBP1表达量对HCC的诊断效果。结果TCGA数据库分析表明,无论是配对样本还是非配对样本,SSBP1 mRNA在HCC组织中的表达水平均高于正常肝组织(P均<0.001),且表达水平与性别和M分期有关(P均<0.05),与年龄、T分期、AJCC分期等无关(P均>0.05)。进一步进行单因素和多因素Cox回归分析发现,SSBP1高表达是影响HCC患者总生存期(OS)的独立危险因素(HR=1.713,P=0.016)。免疫细胞浸润分析发现,HCC组织中SSBP1表达与幼稚B细胞浸润水平呈负相关,而与记忆B细胞和巨噬细胞呈正相关(|r|>0.2,P均<0.05)。ROC曲线分析显示,SSBP1 mRNA表达水平对HCC的早期诊断和预后均具有良好的评估价值(AUC>0.50)。结论SSBP1 mRNA在HCC中的表达增高,且高表达是预后不良的独立危险因素,同时SSBP1对HCC具有良好的诊断价值,可成为HCC患者预后判断一种潜在的分子标志物以及免疫治疗的潜在靶点。

依赖解旋酶DNA等温扩增技术的研究进展

依赖解旋酶DNA等温扩增技术(HDA)是近年来发明的一种新型的模拟动物体内DNA复制的等温扩增技术,HDA具有简便、高效、快速的优点,不需复杂的科学仪器,反应在常温下进行,适用于基层实验室,具有广阔的应用前景。

火球菌复制蛋白A的表达纯化和活性研究

将火球菌(Pyrococcus furiosus)的3个复制蛋白A相关基因pfuRPA41(PF2020),pfuRPA32(PF2018),pfuRPA14(PF2019)克隆到pDEST17质粒,并在E.coli Rosetta(DE3)表达菌株中成功表达,最终通过固定化镍离子亲和层析分别得到纯度较高的三个复制蛋白A相关蛋白,对它们的单链DNA结合活性进行了详细测试.其中单独的pfuRPA41能结合单链DNA,而单独的pfuRPA32以及pfuRPA14不能结合单链DNA;然而pfuRPA32能够促进pfuRPA41的单链DNA结合能力.同时单链DNA长度对pfuRPA41结合单链DNA的能力有显著影响;在一定长度范围内,pfuRPA41结合单链DNA能力与单链DNA长度成正比.

SSBP1在肝癌组织中的表达及意义

目的观察线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)在肝癌组织的表达及意义。方法收集2013年12月至2016年12月手术切除的肝癌患者组织标本80例,采用Real time-PCR和免疫组化SP法检测80例肝癌组织和癌旁组织SSBP1 mRNA和蛋白表达状况,分析其与临床病理参数的关系,并检测SSBP1在肝癌细胞株Hep G2、MHCC97H、SMMC7721、Huh7及正常人肝细胞L-02的表达状况。结果 SSBP1在肝癌组织和癌旁组织的表达水平和阳性表达率分别为1.87±0.23、0.36±0.05和80.00%(64/80)、15.00%(12/80),SSBP1在肝癌组织的表达水平和阳性表达率显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。Hep G2细胞中SSBP1表达水平显著高于MHCC97H、SMMC7721、Huh7及L-02细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。且SSBP1表达与肿瘤大小、AFP、TNM分期、分化程度及有无门静脉癌栓、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。结论肝癌组织和细胞系高表达SSBP1,与临床病理参数有关,且SSBP1高表达提示预后不良。

腹腔镜下胃癌D2根治术在进展期胃癌中的治疗与效果分析

探讨腹腔镜胃癌D2根治术对进展期胃癌的疗效及对溴结构域蛋白、Ki-67、线粒体单链DNA结合蛋白表达的影响。选择2017年1月至2019年1月收治的进展期胃癌患者89例,随机分为微创组43例与传统组46例。传统组实施开腹胃癌D2根治术,微创组行腹腔镜胃癌D2根治术。评价两组各项术后指标、并发症发生情况、手术前后BRD4、Ki-67、SSBP1表达情况以及血清炎症因子水平。微创组手术时间长于传统组,肛门恢复排气时间、住院时间短于传统组,术中失血量少于传统组(均P<0.05)。微创组并发症总发生率低于传统组(P<0.05)。两组术后BRD4、Ki-67、SSBP1阳性率低于术前(P<0.05),但两组组间相比,差异不显著(P>0.05)。腹腔镜胃癌D2根治术治疗进展期胃癌的疗效显著,有效降低并发症和BRD4、Ki-67、SSBP1表达,炎症反应较传统开腹手术轻。

赖解旋酶恒温基因扩增技术的原理、应用和展望

赖解旋酶恒温基因扩增方法(HDA法)是新近发明的一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术.该法依靠DNA解旋酶解开双链DNA、单链DNA结合蛋白(SSB)维持单链状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增.研究表明,HDA能扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等,从灵敏性、准确性和可操作性几方面看,该方法具有广阔的实用前景.

烟草和水稻中水稻条斑病菌过敏反应激发子Ssb_x互作因子的鉴定

【目的】水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola)中单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA-binding protein,SsbX)通过病原菌III型分泌系统(type-III secretion system,T3SS)分泌,在非寄主植物烟草上产生过敏反应(hypersensitive response,HR),研究旨在明确SsbX激发烟草产生HR的机理。【方法】将水稻条斑病菌RS105菌株注射水稻和烟草叶片,应用CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒构建水稻和烟草cDNA文库,借助pGADT-Sfi AB载体上特殊酶切位点SfiⅠ,酶切检测水稻和烟草cDNA文库质量;以SsbX为诱饵,通过酵母双杂交技术(Y2H)从水稻和烟草cDNA文库中筛选在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His培养基上能够生长的阳性克隆;并利用β-gal试验验证阳性克隆;序列测定后,使用MEGA 4序列分析软件,并利用邻位相连法(neighbor-joining,NJ)对筛选获得的互作因子进行同源序列和系统进化树分析;利用荧光双分子互补试验(BiFC)于488 nm处黄色激发光和520—550 nm透射光、20×物镜下,在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5-II)观察SsbX与烟草和水稻中互作因子的互作位点。【结果】水稻和烟草cDNA文库构建和质量检测结果显示,随机挑选20个克隆中水稻来源的cDNA插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.0kb;随机挑选20个克隆中烟草来源的cDNA均插入在pGADT-Sfi AB载体上,平均片段大小1.2 kb,说明水稻和烟草的cDNA文库构建质量较好;Y2H和β-gal试验结果显示,SsbX可与烟草和水稻的ADF2(actin-depolymerization factor 2)蛋白互作,使酵母AH109能够在SD/-Ade/-Leu/-Trp/-His平板上生长,并且β-gal染色显示为蓝色。水稻Os ADF2编码139氨基酸,蛋白质分子量为15.9 k D,而烟草Nb ADF2编码137氨基酸,蛋白质分子量为15.kD,两者同源性达69.02%。同源性以及系统进化树分析显示,植物中ADF2广泛存在,同源性高达60%以上。双子叶植物烟草和拟南芥的ADF2同源性最高,相似性达69.05%;单子叶禾本科植物水稻和狗尾草的ADF2同源性最高,相似性为88.81%。BiFC试验结果显示,在488 nm波长的激光共聚焦显微镜下,仅SsbX和Os ADF2以及SsbX和Nb ADF2共同存在时,可在烟草细胞膜上显示黄色荧光,与阳性对照显示黄色荧光一致,说明SsbX可与Os ADF2或Nb ADF2互作,互作位点发生在植物细胞膜上。【结论】通过T3SS分泌的水稻条斑病菌中的SsbX,在植物细胞膜上与ADF2互作,从而激发植物的免疫性。这为进一步揭示SsbX如何激发植物产生HR的机制提供了依据。

小菜粉蝶颗粒体病毒lef-3基因的克隆与分析

【目的】研究杆状病毒lef-3基因的起源与进化,从分子水平明确病毒之间的亲缘关系。【方法】通过常规PCR方法获得小菜粉蝶颗粒体病毒晚期基因表达调控因子lef-3的基因片段,克隆后测序,然后利用软件对lef-3及编码序列进行生物信息学分析。【结果】克隆得到的PiraGVlef-3基因ORF序列中存在4个突变位点,但氨基酸性质未发生改变,推导PiraGV LEF-3蛋白含399个氨基酸残基,分子量为3.99kD;通过高级结构预测及其编码序列与其它杆状病毒的LEF-3同源性比对表明,该基因可能编码单链DNA结合蛋白;BLAST比对发现lef-3基因只存在于鳞翅目昆虫为宿主的杆状病毒基因组;进化分析表明LEF-3可分为3组,其中GV属的LEF-3聚类为1个组,NPV属的LEF-3聚类为2个组;GV的lef-3基因编码区的选择压力分析表明,大多数lef-3基因间相比较表现为负向选择,但不同lef-3基因间的Ka/Ks不同,也有正向选择;起源分析表明,杆状病毒lef-3基因可能来源于细菌。【结论】获得了小菜粉蝶颗粒体病毒(PiraGV)lef-3基因,通过生物信息学分析推测出了lef-3基因的起源进化规律。

BRD4、Ki-67、SSBP1水平与胃癌前病变进展的关系及在胃癌早期诊断中的价值

目的分析溴结构域蛋白(BRD4)、核抗原Ki-67(简称Ki-67)、线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)水平与胃癌前病变进展的关系及在胃癌早期诊断中的价值。方法选择2016年3月至2019年3月在该院普外科接受手术切除或消化内镜黏膜下剥离术(ESD)切除或胃镜活检获得胃组织的267例患者纳入本研究。其中胃组织包括早期胃癌组织82例,胃癌前病变组织135例,正常胃黏膜上皮组织50例。采用免疫组织化学法分析以上组织BRD4、Ki-67、SSBP1表达水平。结果正常胃黏膜、胃癌前病变和早期胃癌组织中Ki-67阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。正常胃黏膜、胃癌前病变和早期胃癌组织BRD4阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。正常胃黏膜、胃癌前病变和早期胃癌组织SSBP1阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论BRD4、Ki-67、SSBP1水平与胃癌前病变的进展存在一定的相关性,可作为预测胃癌前病变的潜在指标进行深入研究。

靶向沉默SSBP1基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响

目的观察靶向沉默线粒体单链DNA结合蛋白(SSBP1)基因对肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移的影响。方法设计并构建靶向SSBP1基因的特异性siRNA,采用脂质体介导瞬时转染肝癌HepG2细胞,细胞分3组:对照组、空白转染组、转染组。Real time-PCR和Western-blot检测靶向干扰后SSBP1 mRNA和蛋白表达变化。CCK-8法检测细胞增殖。流式细胞仪检测细胞周期、凋亡率及线粒体膜电位。划痕实验及Transwell侵袭实验检测细胞侵袭转移能力。Western-blot检测增殖、侵袭转移相关基因蛋白表达状况。结果 SSBP1 siRNA能够显著抑制SSBP1 mRNA和蛋白表达。与对照组和空白转染组比较,转染SSBP1 siRNA后HepG2细胞增殖能力、G2期和S期细胞比例、线粒体膜电位明显降低,G1期细胞比例、细胞凋亡率明显升高(P<0.05);同时细胞增殖相关基因PCNA、凋亡抑制基因Bcl-2、转移相关基因MMP-9蛋白表达显著下调,凋亡诱导基因Bax蛋白表达显著上调(P<0.05)。结论靶向沉默SSBP1基因能够通过线粒体途径抑制肝癌HepG2细胞增殖、侵袭转移,并诱导其凋亡。

赖解旋酶恒温基因扩增技术的研究进展

随着分子生物学研究领域的发展,赖解旋酶恒温基因扩增技术(HDA)作为一种简便、快速、高效的体外恒温基因扩增技术出现。HDA依靠解旋酶解开双链DNA、结合蛋白维持单链DNA状态、DNA聚合酶催化靶片段的扩增。可以用于微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等的扩增,该法具有广阔的实用前景。

初发急性非淋巴细胞白血病SSBP2 mRNA表达研究

目的:探讨SSBP2 mRNA在初发急性非淋巴细胞白血病中的表达。方法:利用半定量RT-PCR检测64例初发急性非淋巴细胞白血病患者及20例正常对照SSBP2 mRNA表达,以β-actin作为内参照。结果:64例初发ANLL患者及20例正常对照均表达SSBP2。与正常对照比较,初发ANLL患者SSBP2mRNA表达水平为(0.410±0.216)与对照组(0.383±0.172)差异无显著性(P>0.05)。结论:初发ANLL中SSBP2mRNA表达无异常改变,SSBP2表达可能并不参与急性非淋巴细胞白血病的发生。