抗HBs Ag单链Fab抗体基因酵母表达载体的构建

采用重叠PCR技术 ,以抗乙肝表面抗原 (HBsAg)IgG铰链区基因为Linker将Fab抗体基因的重链和轻链连接起来 ,构成单链Fab基因。通过测序鉴定 ,克隆的单链Fab基因与理论上的完全一致 ,并成功构建含完整单链Fab基因的毕赤酵母 (P pastoris)表达载体。

人源性抗HBsAg单链Fab基因在Pichia pastoris中的表达

目的：研究重组Fab的结构与亲和活性的关系：方法：通过重叠PCR，将人源性抗HBsAg Fab的H和L链基因融合构建单链Fab基因，并将其转入毕赤酵母表达载体pPICZαA中。以单链Fab基因表达载体通过氯化锂转化法转化毕赤酵母GS115。将获得的重组酵母在摇瓶中培养进行重组单链Fab的可溶性表达。表达上清经硫酸铵沉淀及亲和层析纯化后，用直接ELISA检测表达产物和纯化Fab的活性：结果：SDS—PAGE和Western blot分析显示，单链Fab在毕赤酵母中获得分泌型表达。薄层扫描显示，在摇瓶中培养毕赤酵母表达的单链Fab约为5～10mg／L。经亲和层析纯化获得纯度达97．8％的重组单链Fab。经直接ELISA测定的结果显示，重组单链Fab具有较好的结合HBsAg的活性。结论：通过重叠PCR构建的融合单链Fab基因，可成功地在毕赤酵母中获得分泌型表达，表达产物具有较好的结合HBsAg的活性。

抗苏丹红单链Fab抗体的构建、表达及功能鉴定

从分泌抗苏丹红Ⅰ单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株SU211中克隆抗体轻链Lc基因和重链Fd基因,将Lc、Fd基因以及Linker克隆到载体pET24a(+)中,构建scFab表达载体并在E.coli BL21(DE3)获得表达,SDSPAGE和Westernblot分析表明其表达形式为包涵体,相对分子质量约为57 kD,与理论预期值相符。经复性后,ELISA鉴定结果表明复性抗体对苏丹红Ⅰ具有很高的结合特异性。本研究为新型基因工程抗体的构建以及苏丹红新型免疫检测技术的建立奠定基础。