重组单链Fv段融合TNFα（mscFv25—TNFα）的导向治疗

目的 希望能得到具有临床应用价值的抗肝癌重组单链Ｆv段－免疫毒素。方法 将抗肝癌重组单链Ｆv段－免疫毒素mscFv25-TNFα在大肠杆菌ＪＭ１０９中以ＩＰＴＧ诱导进行表达。将包涵体形式的表达与产物溶解和折叠后，以GST亲合层析色谱纯化。用间接免疫荧光染色测定纯化后目的蛋白的活性。MTT试验鉴定 mscFv25-TNFα对靶细胞SMMC－7721的杀伤活性。通过对荷肝癌（SMMC－7721）裸鼠进行体内初步抑瘤实验。检测mscFv25-TNFα的导向治疗的效果。结果 纯化的目的蛋白间接免疫荧光染色呈阳性，MTT实验提示，在放线菌素D存在的情况下，体外mscFv25-TNFα对靶细胞SMMC－7721具有细胞毒作用。实验组14只裸鼠中4只的移植瘤的生长完全得到抑制，而TNFα对照组无完缓解。结论 间接免疫荧光染色表明，mscFv25-TNFα的特异性和亲和力与亲本抗体HBb25相比较没有明显下降。荷肝癌裸鼠体内的抑瘤实验显示，mscFv25-TNFα对荷肝癌裸鼠体内直径2－4mm左右的肿瘤具有一定的杀伤作用，初步证明mscFv25-TNFα具有一定的临床应用潜力。

噬菌体展示技术构建和表达抗人整合素β_1单链Fv抗体(英文)

整合素 (Integrins)是细胞膜蛋白的组成成分 ,它们是一类细胞粘附分子 ,并与形态形成的调节密切相关。整合素在细胞与细胞之间 ,细胞与基质之间的粘附中发挥着重要的作用。本研究通过选择使用鼠抗人整合素 β1抑止性单克隆抗体和刺激性单克隆抗体 ,利用噬菌体展示技术 ,成功地构建了单链Fv抗体 (scFv) ,并对其与整合素 β1的结合 ,选择最佳的可溶性抗体的生产条件等诸方面 ,进行了应用性研究。同时 ,也应用链转换 (Chainshuffling)

抗肿瘤侵袭与转移单链抗体scFv-M97基因克隆及分泌性表达

目的研制抗肿瘤侵袭和转移的单链抗体。方法应用重组噬菌体抗体技术,从小鼠抗Ⅳ型胶原酶杂交瘤C2H5细胞中提取mRNA,构建单链抗体基因并克隆到噬粒pCANTAB5E中,转化大肠杆菌TG1,经M13KO7援救后,得到滴度为5×10~9pfu/ml单链抗体库。对抗体库进行一轮抗原固相化亲和富集与ELISA筛选鉴定,得到30株阳性噬菌体。结果 DNA序列分析表明,抗Ⅳ型胶原酶单链抗体scFv-M97基因全长732bp。其中V_H351bp,编码117个氨基酸;V_L336bp,编码112个氨基酸,两者以连接肽(Gl_(y_4)Ser)_3相连。阳性噬菌体转染HB2151细胞,经1 mmol/L IPTG诱导培养20h,培养液上清中有2μg/ml可溶性单链抗体。免疫印迹证实所表达产物保留了原亲本抗体的特异性和亲合力。结论单链抗体scFv-M97可分泌性表达,为以Ⅳ型胶原酶为靶点的抗肿瘤侵袭与转移的治疗及新型导向药物的研制奠定了基础。

超抗原葡萄球菌肠毒素与抗人大肠癌单链抗体ND-1 scFv融合基因的构建、表达及活性分析

目的:构建并表达超抗原葡萄(SEA)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,以提高SEA的靶向杀伤作用。方法:构建超抗原SEA和鼠抗人大肠癌单链抗ND-1scFv的融合基因ND-1 scFv/SEA的表达载体,转化到大肠杆菌E.coli M15中进行诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化。间接免疫荧光法检测融合蛋白的靶向结合活性,MTT法检测靶向杀伤效率。结果:成功构建了融合基因ND-1scFv/SEA,实现功能性表达,纯化的ND-1scFv/SEA融合蛋白与表达有ND-1相应抗原的大肠癌细胞CCL-187有高度亲和活性,通过激活外周血单核细胞,可特异性杀伤靶细胞,在4μg/mL浓度下对CCL-187的杀伤率达到91%,明显优于SEA的杀伤活性。结论:融合蛋白ND-1 scFv/SEA对大肠癌细胞CCL-187具有靶向结合和杀伤活性,为SEA用于靶向性的大肠癌治疗奠定了基础。

单链抗体与力达霉素辅基蛋白在大肠埃希菌表达的发酵工艺

目的确定工程菌E.coli BL21(DE3)Star^(TM)/pEFL表达抗Ⅳ型胶原酶单链抗体与力达霉素辅基蛋白构成的融合蛋白Fv-LDP的摇瓶发酵工艺。方法比色法测定菌体浓度,干燥失重法测定细菌干重,SDS-PAGE-Spot Denso法测定融合蛋白Fv-LDP表达量,单因素或正交设计优化发酵工艺。结果确定了融合蛋白Fv-LDP表达的最佳培养基配方和培养条件,融合蛋白Fv-LDP表达量为830μg/ml左右,比LB培养基的产量提高5.6倍。结论优化工程菌发酵工艺大大提高了融合蛋白Fv-LDP表达水平,不仅为下一步中试研究和规模化生产奠定了基础,而且为其它生物来源的抗体和抗生素组分在基因工程大肠埃希菌的生产提供了发酵方面的实验证据。

一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建

目的构建大容量天然人源核糖体展示单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,为抗体研究提供方便有效的技术平台。方法收集健康献血志愿者的白细胞悬液,离心分离单个核细胞,抽提其总RNA,逆转录成cDNA、PCR及重叠延伸PCR法构建scFv文库,并通过第2次重叠延伸PCR在scFv DNA序列5′端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,其3′端添加6×His标签、间隔序列(基因Ⅲ)、茎环结构等改造成核糖体展示天然人源scFv文库。结果成功构建了可用于筛选抗体的核糖体展示文库容量达1013以上。结论成功构建了大容量天然人源核糖体展示scFv文库,为筛选到高亲和力和特异性抗体提供了技术平台。

小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选

目的 构建并筛选小鼠抗人静息 /活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库。方法 以人静息 /活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠 ,取脾细胞 ,RT -PCR扩增VH 和VK 基因 ,拼接为ScFv ,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌 ,构建了噬菌体展示抗体库 ,以人T淋巴细胞为靶抗原 ,对该库进行了 3轮淘洗 ,ELISA方法鉴定噬菌体抗体。结果 成功构建了最大实际库容量为 1 .75× 1 0 6的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库。结论 所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体。

重组方法制备象IgG的双特异性抗体

用传统的方法,象杂交瘤技术和化学合成方法,制备高质量高产量的双特异性单克隆抗体(BsAb,bispecific antibodies),现在还存在着很多问题。虽然重组BsAb片段(例如双特异抗体和串联单链Fv)快速而显著的发展,但是全长象IgG BsAb的成功设计和制备还受到限制。不像小片段,在血清中,象IgG BsAb有很长的半衰期并能支持二次免疫功能,依赖抗体的细胞毒性和补体介导的细胞毒性。作为治疗试剂象IgG BsAb的发展,要以设计重组BsAb结构(或者形式)和高效的产量为重要的基础。这篇文章主要围绕着各种基因工程的重组方法进展以及制备象IgG BsAb来阐述的。

改善癌症治疗的单克隆抗体

单克隆抗体已成为治疗许多人类疾病包括癌症的药物。医药史上 ,没有足够数量又高特异靶向实体瘤的单克隆抗体的存在 ,已妨碍成为有效治疗药的障碍。本文着重报道在直接改善基于抗体的治疗药物的靶向和加强药物靶向肿瘤后的疗效的抗体工程学研究方面的新进展。

转铁蛋白介导的单克隆抗体治疗胶质瘤动物模型

目的观察转铁蛋白受体单链抗体Fv片段介导的Survivin-siRNA治疗胶质瘤动物模型的效果。方法构建雌性裸鼠的胶质瘤动物模型,设计Survivin-siRNA,构建Survivin-siRNA质粒,构建单链Fv片段抗体-转铁蛋白,将单链抗体-转铁蛋白(scFV)与Survivin-siRNA结合。实验分为对照组、单纯质粒组、对照基因质粒组(Si-M组),Survivin-siRNA质粒组(SiS组),单链抗体Fv片段-转铁蛋白组(scFV组),转铁蛋白受体单链抗体Fv片段Survivin-siRNA组(Si-S-P-scFv组)。分别观察各组裸鼠脑内Survivin蛋白表达与各组裸鼠生存时间。结果小鼠Survivin蛋白表达,Si-S组受到轻度抑制,Si-S-P-scFv组受抑制较强(P<0.01)。小鼠生存时间,Si-S组高于对照组(P=0.02);与对照组和Si-S组比较,Si-SP-scFv组小鼠生存时间最长(分别为P<0.001,P=0.018)。结论转铁蛋白受体单链抗体Fv片段介导的Survivin-siRNA可较理想通过胶质瘤动物模型的血-脑脊液屏障,能明显延长实验动物生存时间。

抗人大肠癌单链抗体与绿色荧光蛋白融合基因的构建和表达

目的构建并表达绿色荧光蛋白(GFP)和鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的融合蛋白,产生具有荧光的抗体。方法将鼠抗人大肠癌单链抗体ND-1scFv的基因克隆到pET28a(+)-GFP的表达载体,转化到大肠杆菌BL21中进行融合基因ND-1-scFv/GFP诱导表达。Ni-NTA亲和层析对表达产物进行分离、纯化,免疫印迹和荧光显微镜方法验证融合蛋白的表达。结果 ND-1scFv被克隆到表达载体pET28a(+)-GFP中,诱导表达的融合蛋白以包涵体形式存在,分子量为58kDa。SDS-PAGE灰度扫描结果显示纯化后的蛋白纯度为90%,荧光显微镜检测显示,表达有目的蛋白的大肠杆菌BL21具有明显的绿色荧光。结论成功构建并表达融合基因ND-1-scFv/GFP,为该单抗的肿瘤特异成像研究奠定了基础。E.