大豆单锌指蛋白基因GmSZFP的克隆及其在SMV与寄主互作中的功能

【目的】由大豆花叶病毒(soybean mosaic virus,SMV)引起的大豆花叶病是世界性大豆病害之一,利用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)技术研究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中发挥的功能,为深入探讨其分子机制奠定基础。【方法】以大豆品种冀豆7号与SMV毒株SC-8、N3组成的亲和、不亲和组合为试验材料,运用生物信息学预测GmSZFP的分子结构特征;以酵母转录激活试验检测其转录因子活性;借助实时定量PCR(RT-qPCR)验证GmSZFP在大豆与SMV互作中转录水平的表达特征;结合VIGS技术探究GmSZFP在大豆与SMV互作过程中的功能。【结果】通过PCR克隆GmSZFP的CDS区,序列全长为1071 bp;氨基酸序列分析和酵母转录激活试验发现GmSZFP为C2H2型锌指蛋白转录因子,且具有转录激活活性;RT-qPCR结果显示,GmSZFP受SMV的强烈诱导,在亲和组合与不亲和组合中的表达模式不同,在不亲和组合中,GmSZFP呈先上升后下降的表达趋势,其表达水平明显高于亲和组合,若在接种病毒前给叶片预注射咪唑,GmSZFP的表达水平降低,并与亲和组合相近,说明GmSZFP在转录水平响应SMV的侵染并受胞内H2O2信号调控;利用VIGS技术沉默GmSZFP后,发现接种部位胼胝质的积累水平较对照大大降低,RT-qPCR检测胼胝质合酶基因GmGSL7c和GmGSL12b的表达量较对照降低,胼胝质水解酶基因BG的表达量较对照增加;在基因沉默植株叶片上点接种SMV后72 h,病毒向外扩散至2 mm,在96 h时病毒扩散至3 mm,而对照组叶片在接种点外始终未能检测到SMV外壳蛋白CP的表达;摩擦接种SMV后10 d,在基因沉默植株的上位叶表现出花叶、失绿和卷曲等感病症状,并检测到CP的表达,说明沉默GmSZFP后,SMV在胞间扩散和长距离运输的能力均增强。【结论】大豆GmSZFP是典型的C2H2型单锌指蛋白,GmSZFP在大豆抵抗SMV侵染过程中发挥正调控作用。

水稻泛素连接酶D3与抗病相关蛋白VOZ2的互作分析

多蘖矮秆基因dwarf-3(D3)是水稻独脚金内酯信号转导过程中的重要节点基因,拟南芥中的MAX2基因与D3同源,且MAX2参与拟南芥的抗病防卫反应。本研究以水稻泛素连接酶D3为诱饵进行酵母双杂筛库,发现水稻抗病相关蛋白维管植物单锌指蛋白VOZ2与D3存在潜在的相互作用。通过酵母双杂交试验证实,D3与VOZ2存在互作。通过荧光定量PCR证实,接种水稻白叶枯病菌后,VOZ2基因在转录水平上的表达受到显著诱导。利用水稻原生质体开展的亚细胞共定位实验发现,D3与VOZ2共定位于细胞核。双分子荧光互补实验发现,D3与VOZ2在烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质均产生较强的荧光,进一步证实了D3与VOZ2的相互作用。研究结果为进一步探究D3和VOZ2在水稻抗病防卫反应中的功能与分子机理奠定了基础。