南方型紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子鉴定与分析

转录因子可以调节众多下游基因的表达,在植物抗逆境中起重要的调节作用。为了解析转录因子在南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制,以南方型紫花苜蓿Medicago sativa‘Millennium’为材料,以正常培养(WT_ck1)和氯化钠(盐)胁迫(WT_N1)条件下的2个样品根系进行转录组分析,鉴定紫花苜蓿根系盐胁迫应答转录因子基因。同时,随机挑选4个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量q RT-PCR(3次重复),验证转录组测序技术(RNA-Seq)结果的可靠性。结果表明:紫花苜蓿根系在250 mmol·L-1氯化钠胁迫下72 h,共检测到31 907个基因表达量发生了改变,表达量差异达到2倍以上的基因共2 758个。其中,隶属于38个转录因子家族199个转录因子在盐胁迫下差异表达,上调表达104个,下调表达95个。在各转录因子家族中,盐胁迫应答基因数量最多的是MYB基因家族,其后分别是AP2-EREBP,b HLH,WRKY,NAC和GRAS基因家族,这暗示了紫花苜蓿根系对盐胁迫响应可能是多种转录因子家族共同参与的应答过程。q RT-PCR分析表明:4个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。此外,Ms ERF-2b,Msb HLH,Msb ZIP,Ms GRAS,Ms NAC,Ms MGT-3a和Ms WRKY等转录因子被选为与盐胁迫应答相关的候选转录因子。该研究结果为阐明植物对盐胁迫的应答机制提供了新的线索。

南方型紫花苜蓿耐盐细胞系的筛选及生理特性分析

以NaCl为选择因子,对长期继代培养的紫花苜蓿愈伤组织进行选择,筛选出耐1.2%NaCl的耐盐细胞系并对其进行生理分析,结果表明:耐盐细胞系对逆境的忍受能力高于对照,积累的脯氨酸和可溶性蛋白含量也高于对照,维持着较高的K+/Na+比,在盐分胁迫下能维持较高的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性。

南方型紫花苜蓿叶片响应盐胁迫蛋白质组和转录组关联分析

为了从基因和蛋白质水平上揭示南方型紫花苜蓿适应盐胁迫环境的分子机制,以南方型紫花苜蓿Millennium为材料,对正常培养和盐胁迫条件下的2个样品叶片进行转录组和蛋白质组关联分析。结果表明,定量蛋白和基因关联系数为0.2485;变化趋势相反差异蛋白和基因表达的关联系数为-0.2440;变化趋势相同差异蛋白质和基因表达的关联系数为0.8122。鉴定出109个与差异基因表达趋势相同的差异蛋白,其中77个上调,32个下调,这些差异蛋白功能涉及光合作用、抗氧化物、信号传递、翻译后修饰、翻译和分子伴侣、胁迫防御、能量产生与转运、代谢和其它未知功能蛋白等。下调表达的蛋白主要与光合作用相关,而上调表达的蛋白主要参与了抗氧化物、信号传递和胁迫防御等。此外,关联发现了与紫花苜蓿盐胁迫响应相关的III类过氧化物酶、铁蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C、LRR类受体激酶、ABA反应蛋白、钙联接蛋白2、液泡H+-ATP酶C亚基和NADP-苹果酸酶等差异蛋白。本研究通过高通量多组学数据的关联分析,发现一些可能作为紫花苜蓿耐盐潜在靶标蛋白(基因),这为深入认识紫花苜蓿盐胁迫的应答分子调控机制奠定了坚实的基础。

南方型紫花苜蓿Millennium组织培养及其再生

以南方型紫花苜蓿Millennium种子发育5~7 d无菌苗的子叶、下胚轴为外植体,对紫花苜蓿愈伤组织诱导和植株再生进行了研究。结果表明,在愈伤组织诱导中,下胚轴为最佳外植体材料,出愈率随着2,4-D质量浓度的增加呈明显的升高趋势,最佳愈伤组织诱导培养基为2,4-D 2 mg/L＋6-BA 0.5 mg/L,诱导率达到100%。紫花苜蓿诱导最佳愈伤组织的分化培养基为MS＋KT 1.0 mg/L＋NAA 0.05 mg/L,下胚轴愈伤组织分化率达到58%,子叶愈伤组织分化率达到40%。将苗切下转接到1/2 MS＋20 g/L蔗糖质量浓度时,培养6 d即可诱导生根,诱导生根率达到100%,完成植株再生仅需60~70 d。成功地建立了南方型Millenni-um紫花苜蓿子叶和下胚轴的离体培养再生途径,并获得了再生植株。

南方型紫花苜蓿叶片盐胁迫应答转录因子鉴定与分析

以南方型紫花苜蓿‘Millennium’为材料,以正常培养(WT_CK2)和250 mmol·L-1Na Cl胁迫下72 h时(WT_N2)条件下的2个样品叶片进行转录组分析,鉴定紫花苜蓿叶片盐胁迫应答转录因子基因。同时随机挑选4个转录因子差异表达基因进行实时荧光定量qRT-PCR验证RNA-Seq结果的可靠性。紫花苜蓿叶片在250 mmol·L-1Na Cl胁迫下72 h时,检测到表达量差异达到2倍以上的基因共7 497个,其中包括隶属于46个转录家族474个转录因子在盐胁迫下的差异表达,上调242个,下调232个。b HLH,NAC,WRKY和C2H2转录家族成员基因70%以上表达上调。实时荧光定量PCR分析表明4个随机选择的基因在胁迫前后的表达特点与表达谱测序结果一致。此外,还发现大量紫花苜蓿盐胁迫应答的转录因子候选基因如Ms ERF110,Ms ERF071,Msb HLH36,Ms ZFP,Ms HSFB-3,Ms MYB,Ms NAC和Ms WRKY等。同时,也揭示了紫花苜蓿叶片对盐胁迫响应可能是多种转录因子家族共同参与的应答过程。

南方型紫花苜蓿耐盐突变体叶片盐胁迫应答转录因子鉴定与分析

转录因子可以调节众多下游基因的表达,在植物抗逆境中起重要的调节作用。以南方型紫花苜蓿Medicago sativa‘Millennium’的耐盐突变体为材料,以正常培养(MT_CK2)和盐胁迫(MT_N2)条件下的2个样品叶片进行转录组测序分析,并进行qRT-PCR验证RNA-Seq结果的可靠性,研究耐盐突变体叶片盐胁迫应答相关转录因子基因。结果表明:经过250 mmol/L NaCl胁迫72 h,共检测到30 900个基因表达量发生了变化,7 694个基因差异表达,共有隶属于50个转录家族的422个转录因子发生了差异表达,上调表达268个,下调表达154个。盐胁迫应答基因数量最多的是MYB基因家族,其次是WRKY、NAC、b HLH和AP2-EREBP转录家族。此外,候选出MsANT、Msb HLH36、MsNAI1、Msb ZIP、Msb ZIP73A、MsC3H、MsMYB85、MsNAD、MsMYB、MsNAC、MsTrihelix和MsWRKY等与盐胁迫应答相关的重要转录因子。本研究为揭示紫花苜蓿盐胁迫分子机制奠定基础。

南方型紫花苜蓿(Medicago sativa ’Millenium’)耐盐相关miRNAs及靶基因预测

为了解盐胁迫下南方型紫花苜蓿(Medicago sativa‘Millenium’)的内在分子机制,挖掘其与耐盐相关的miRNA及相关靶基因。以250 mmol/L NaCl溶液处理72 h后的南方型紫花苜蓿耐盐突变体根部为材料进行Illumina HiSeq^TM2000高通量测序,构建6个南方型紫花苜蓿突变体根部盐胁迫前后sRNA文库,共获得分属于79个家族的447个已知miRNA及146个新miRNA,并在已知miRNAs中筛选出盐胁迫差异表达miRNA46个(12个上调,34个下调),新miRNA中筛选出差异表达miRNA19个(7个上调,12个下调)。利用psRNATarget、TargetFinder和Tapirhybrid软件对所获得的差异表达miRNA进行靶基因预测,预测得到1 190个靶基因,基因本体(Gene ontology)功能分析揭示了这些靶基因的两个主要功能类别,即分子功能与生物过程。为验证高通量测序数据的可效性,筛选6个miRNA及其靶基因进行qRT-PCR验证,实验表明这些miRNA均被检测发现且大部表达结果与测序结果一致。此外,还鉴定出部分差异表达miRNA的靶基因,这些基因参与植物生长、发育及盐胁迫反应。本研究表明,盐胁迫下,南方型紫花苜蓿耐盐突变体通过体内miRNA调控一系列转录因子的方式提高植株耐性,减少盐胁迫对植株的伤害。

基于转录组和蛋白质组关联研究技术筛选紫花苜蓿耐盐相关候选基因

通过高通量多组学数据的整合分析,可以为诠释植物耐盐分子机制提供新思路。以南方型紫花苜蓿‘Millennium’为材料,对正常培养和盐胁迫条件下的2个样品根系进行转录组和蛋白质组关联分析,以期发现紫花苜蓿耐盐相关候选基因。结果表明:蛋白质组和转录组相关性并不高,定量蛋白和基因关联系数为-0.0013;变化趋势相反差异蛋白和基因的表达关联系数为-0.3648;变化趋势相同差异蛋白和基因的表达关联系数为0.2620。鉴定出与差异蛋白表达趋势相同的差异基因25个,上调表达14个,下调表达11个,这些差异基因涉及代谢、信号转导、蛋白质降解、防御、抗氧化、细胞骨架、膜与转运、转录和其他未知等方面的功能。另外,关联分析发现TIP1;1型水通道蛋白(AQP)、钙调素结合蛋白(Ca MBP)、富亮氨酸重复类受体激酶(LRR-RLK)、C2H2型锌指蛋白(ZFP)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-Glu)、晚期胚胎富集蛋白(LEA)、蔗糖合成酶(SS)、ATP结合盒转运蛋白(ABC)和III类过氧化物酶(PRXs)等差异基因可能在紫花苜蓿耐盐中发挥重要作用。该研究表明:利用转录组和蛋白质组的关联研究技术可以有效地发现紫花苜蓿耐盐相关候选基因,为阐明紫花苜蓿对盐胁迫的应答机制提供新线索。