南方水稻黑条矮缩病毒P7-2基因的克隆与原核表达

【目的】为克隆获得南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的P7-2基因并实现其原核表达。【方法】利用RT-PCR技术从感染SRBSDV的水稻叶片中扩增出P7-2基因。利用Gateway重组技术将基因P7-2整合到原核表达载体pDEST17上,获得重组原核表达载体pDEST17-P7-2。随后将原核表达载体pDEST17-P7-2转化到原核表达菌株Rosetta中。利用IPTG诱导P7-2蛋白表达并优化其诱导条件。【结果】利用RT-PCR技术扩增得到基因P7-2,其大小为930 bp。测序结果表明获得原核表达载体pDEST17-P7-2。菌液PCR鉴定了原核表达阳性菌株。在温度为28℃、IPTG浓度为0.1 mmol/L诱导表达8 h,可获得大量大小约为42 kDa含HIS标签的融合蛋白。【结论】克隆获得了SRBSDVP7-2的基因序列,实现了该基因的原核表达并探索其最佳诱导条件,为南方水稻黑条矮缩病的田间诊断、预测预报及P7-2的功能研究奠定了基础。

南方水稻黑条矮缩病抗病遗传资源与分子机理研究进展

南方水稻黑条矮缩病(Souther rice black-streaked dwarf virus disease,SRBSDVD)是依靠白背飞虱(Sogatella furcifera)为传播介体,由南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)侵染引起的一种水稻病毒病。该病害于2001年在我国华南地区首次被发现,随后发生面积不断扩大,危害逐年加重,已成为近年来危害中国南方稻区水稻生产的重要病害之一。白背飞虱迁飞性强、种群数量大、传毒持久等特点,导致化学农药防虫治病效果并不理想,至今还未有可持续和绿色控制SRBSDVD的手段。根据病原病毒的爆发性及其传播介体白背飞虱的生物学特性,预计该病害在未来较长的一段时期内将是我国最严重的水稻病害之一,很有可能再次暴发流行。因此,当前生产上急需培育出能够抵御SRBSDVD的抗性水稻品种。本文综述了SRBSDVD的发病规律、抗病种质资源的收集与评估、抗病基因或数量性状位点(QTL)的精确定位,以及这些抗性基因的分子作用机制,进一步探讨了利用现代分子生物学技术,包括分子标记辅助选择、基因沉默(RNAi)和基因编辑等技术加快SRBSDVD抗病品种的选育,可为今后有效控制SRBSDVD提供基础。

一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒是近年来在水稻上危害日益严重的两种病毒,由于两者同属于呼肠孤病毒科斐济病毒属,在症状、粒体形状、传播介体及寄主等方面非常相似,由此也给诊断及鉴定造成了困难。针对这一问题,通过设计简并引物,并优化体系,建立了一种快速、简便、灵敏、特异的方法,为这两种病毒的检测及鉴别提供了方便。

湖北发生的水稻矮缩病是南方水稻黑条矮缩病毒引起的

近年来由水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病在华南、华东等地区暴发流行,给水稻生产带来严重损失,而湖北一直未有水稻黑条矮缩病流行的报道。然而,2009年和2010年在湖北省长江沿线的荆州、孝感、咸宁、黄石、鄂州、黄冈等水稻种植区普遍发生水稻矮缩减产的现象。经过症状观察、dsRNA电泳图谱分析、RT-PCR等方法,诊断该病是由南方水稻黑条矮缩病毒引起,说明该病毒已经随介体昆虫白背飞虱从我国南方传播至中部水稻种植区。

南方水稻黑条矮缩病毒快速检测

南方水稻黑条矮缩病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)引起的新水稻矮缩病近年在越南北部和我国南方各省爆发,准确快速地检测病毒是病害预测的关键。本文针对该病毒的S10序列设计了一对新的引物S10F/S10R,利用一步法RT-PCR,对2010年5~8月间湖南省下属各县送来的疑似感染该病毒引起的水稻矮缩病样本进行了检测,结果显示,新引物能有效地区分阳性样品和非阳性样品。同时对PCR产物进行了序列测定,结果表明序列均与已发表的南方水稻黑条矮缩病毒序列(登录号:EU523360和EU784840)达约99%的同源性。还在此基础上构建了系统发育树,发现SRBSDV湖南、广东和海南分离物病毒位于一个相对独立的分支。研究发现相对以往的巢式RT-PCR,本文采用的新引物及一步法RT-PCR能快速检测南方水稻黑条矮缩病毒,简化了操作步骤,缩短了检测时间,适合在SRBSDV检测和病害预测中应用。

南方水稻黑条矮缩病毒S6编码一个沉默抑制子

【目的】分析南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)基因组S6编码的SP6蛋白的抑制子活性,明确SRBSDV是否编码RNA沉默抑制子来干扰植物的沉默。【方法】将分别含有SP6与GFP质粒的农杆菌共浸润转GFP基因的16c本氏烟纯合系,观察SP6对局部沉默和系统沉默的抑制作用;将含有SP6,GFP和dsGFP质粒的农杆菌三者共浸润,观察SP6对由dsRNA引起的沉默的抑制作用;在同一植株不同部位接种GFP和SP6,观察SP6对RNA沉默信号传导的影响;通过马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)在本氏烟上表达SP6,观察SP6是否能增强PVX的致病性。【结果】SP6能抑制由GFP正义RNA介导的沉默,但其抑制作用较弱,仅能延缓局部沉默和系统沉默的产生。SP6能灭活RNA沉默信号,阻止沉默信号的长距离传导,回复GFP的沉默,但不能抑制由dsRNA引起的沉默。利用PVX在本氏烟上表达SP6能增强PVX的致病性。【结论】SP6是病毒编码的RNA沉默抑制子,在RNA沉默的起始和信号传导阶段起作用。

水稻黑条矮缩病毒与南方水稻黑条矮缩病毒的检测及其在江西省的区域分布

为明确水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)这2种病毒在江西省的分布,首先从永修县、南昌县和大余县等8县市采集水稻疑似矮缩病株,用2种病毒一步检测法对这2种病毒进行RT-PCR检测。结果表明:永修县所有样品均检出RBSDV,检出率为100%;南昌县同时检出RBSDV和SRBSDV,检出率分别为90%和20%,其中南昌县的1个样品同时检出2种病毒,存在复合侵染;大余县、莲花县、崇义县、婺源县、万安县和井冈山市等6县的所有样品均检出SRBSDV,检出率100%。然后,对这2种病毒在江西省的分布特点进行分析。统计分析结果表明:江西省西南部和东北部只有SRBSDV分布,江西省北部只有RBSDV分布,而处于以上3个病毒重发区之间的南昌县同时有RBSDV和SRBSDV分布。同时基于S9序列和S10序列建立这2种病毒及其近缘种的系统发育树,分析其亲缘关系。

室内试验证实南方水稻黑条矮缩病毒不经水稻种子传播

为了检验南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是否经水稻种子传播,从广东省多地水稻病株上采集种子,温室内防虫栽培,获得了10个品种1875株实生植株。表型观察未发现呈现病毒病症状的植株,RT-PCR检测也未发现SRBSDV阳性植株,结果证实SRBSDV不经水稻种子传播。

双重RT-PCR法同时快速检测南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)在病害症状、传播介体及寄主等方面非常相似,田间很难对其进行诊断及鉴定。根据SRBSDV与RBSDV外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列差异设计特异性引物,建立一种快速、准确的双重PT-PCR鉴别方法,为SRBSDV和RBSDV的流行监测提供技术支持。

抗水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的双价RNA沉默载体的构建

为利用RNAi技术获取抗水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)植株,分别针对两种病毒的S6和S10基因构建RNA沉默载体。采用重组PCR方法将RBSDV S6基因片段(R6)和SRBSDVS6基因片段(SR6)进行融合,获得600 bp的R6-SR6融合基因;将RBSDV S10基因片段(R10)和SRBSDV S10基因片段(SR10)进行融合,获得600 bp的R10-SR10融合基因。融合基因以反向重复的方式连入pBS载体,并定向插入到pCAMBIA1301载体上,获取了含有发夹结构的植物表达载体pCAMBIA1301-hp(R6-SR6)和pCAMBIA1301-hp(R10-SR10)。抗RBSDV和SRBSDV RNA沉默载体的构建为利用RNA沉默进行植物抗病毒研究奠定了基础。

南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白p10的原核表达和抗血清制备及应用

南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)p10蛋白由其基因组片段S10编码,根据SRBSD海南分离物S10序列(EU523360)设计特异性引物扩增编码p10蛋白的片段,并亚克隆至原核表达载体pET-28a+,以大肠杆菌BL21plysS为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的p10蛋白免疫兔子,制备了p10蛋白的特异性抗血清。ELISA检测显示,p10蛋白的抗血清可与来自湖南不同地区的白背飞虱病汁液发生强烈的血清学反应,表明该抗血清适用于田间SRBSDV的快速诊断。

安徽省水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的分子检测和序列分析

近年来,水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)在安徽各稻区危害日益严重,生产上仅凭症状难以区分2种病毒。本研究建立的RT-PCR方法可以实现一次性检测和鉴定RBSDV和SRBSDV 2种病毒,根据RBSDV和SRBSDV S9保守序列设计3个引物,不仅可以从单独感染RBSDV或SRBSDV的水稻样本中分别扩增出1条大小不同的特异性条带,而且还可以从感染RBSDV和SRBSDV的混合水稻样本中一次性扩增出2条大小不同的特异性条带。从安徽省庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市4个地区水稻田采集表现明显矮缩病症状的水稻样本,RT-PCR检测结果表明,庐江和郎溪水稻样本受到RBSDV侵染,怀宁和宣州水稻样本受到SRBSDV侵染。选取庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市各1个水稻样本,利用RT-PCR扩增出特异性条带,再分别克隆和测序。序列分析表明,庐江、郎溪2个样本的核苷酸序列与RBSDV-Shandong和RBSDV-Zhjr S9部分片段序列相似性高达99.3%～99.8%,且与RBSDV的亲缘关系最近,说明庐江和郎溪样本感染的病毒是RBSDV的2个分离物;怀宁、宣州2个样本的核苷酸序列与SRBSDV-Shangdong和RBSDV-2 S9部分片段序列相似性高达99.5%,且与SRBSDV亲缘关系最近,说明怀宁和宣州样本感染的病毒是SRBSDV的2个分离物。

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的亚细胞定位研究

病毒蛋白的亚细胞定位可以反映病毒的某种功能,是研究病毒功能的重要依据。借助农杆菌的介导,将南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)可能编码的6种非结构蛋白分别在本氏烟细胞中表达,通过荧光共聚焦显微镜观察所表达的蛋白亚细胞定位情况。结果表明:Pns52、Pns91定位相似,主要定位于细胞质,在细胞质中形成较大的颗粒状聚集体;Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似,分散于整个细胞,主要定位于细胞质中或膜上,均形成丝网状结构;WoLF PSORT对比分析显示它们可能都是膜内在蛋白(Integral membrane protein),此外,Pns6在细胞质中还可以形成颗粒状的聚集体。

探讨不同因素对白背飞虱在稻苗间传播南方水稻黑条矮缩病毒效率的影响

结果表明,白背飞虱（5龄若虫、长翅型和短翅型成虫）在18～34℃的温度区间内均能在不同生育期的水稻上传毒,传毒率在3.3%～41.2%间.介体发育阶段、环境温度和水稻生育期均能显著影响该虫的传毒能力（P 〈0.01）,不同发育阶段白背飞虱的传毒能力依次是5龄若虫〉短翅型成虫〉长翅型成虫；26℃时该虫传毒率最高,其次是22℃,最后依次是28℃、18℃和34℃；苗龄越低传毒率越高.这三者中任意2因素间都有极显著的互作效应（P 〈0.01）,它们对该虫传毒的影响顺序依次是温度〉水稻生育期〉介体发育阶段〉环境温度×介体发育阶段〉环境温度×水稻生育期〉介体发育阶段×水稻生育期.不同品种的感染率不同,5个品种感染率从高到低的顺序分别是陵两优268（41.7%）、金优899（37.6%）、金优284（36.2%）、培两优981（32.1%）和威优644（29.3%）.其中,陵两优268的感染率显著高于其它品种（P〈0.05）,金优898和金优284之间感染率差异不显著（P〈0.05）,威优644的感染率显著低于其它品种（P〈0.05）.禁食时间在12 h以上时,该虫传毒能力显著降低（P〈0.05）.白背飞虱在稻苗间的传毒效率与水稻品种、环境温度、该虫发育阶段、水稻品种及生育期、该虫禁食时间长短密切相关,其中水稻生育期、温度和白背飞虱的发育阶段间还存在极显著的互作效应.

南方水稻黑条矮缩病毒湖南分离物S9片段ORF序列分析

本文克隆了湖南省2011-2013年水稻的15个SRBSDV分离物S9两个基因,并测定了其核苷酸序列,序列分析与比较表明,S9两个ORF序列同源性均大于99.5％.突变位点分析表明,S9编码的两个ORF有3～9个突变位点,但大部分的核酸突变为无义突变.系统发育分析表明,S9编码的两个ORF高度同源,处于相同的的系统发育分支.

南方水稻黑条矮缩病毒安徽分离物S5片段的克隆及S5-2基因的原核表达

【目的】探讨南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)安徽分离物(SRBSDVAn Hui-HN2)的遗传特性,并获得原核表达的P5-2蛋白。【方法】RT-PCR扩增SRBSDV S5片段,克隆、测序并进行序列分析。将S5-2基因插入原核表达载体,重组载体转化大肠埃希菌并用IPTG诱导,Ni2+-NTA亲和柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE分析P5-2蛋白的表达情况。【结果】SRBSDV-An Hui-HN2 S5片段全长3 167 bp,包含S5-2基因全长612 bp,编码204个氨基酸。序列比对结果显示,SRBSDV-An Hui-HN2 S5片段与其他SRBSDV分离物S5片段的序列相似性极高,达99.0%~99.7%,而与斐济病毒属(Fijivirus)其他成员S5片段的序列相似性较低,仅为38.0%~71.3%;构建的S5片段系统发育树表明SRBSDV和RBSDV聚成1个分支,其中6个SRBSDV分离物聚成1个亚分支。原核表达获得相对分子质量约为47 000的重组蛋白,Western blot分析显示,GST单抗能够与重组融合蛋白发生特异性反应。【结论】SRBSDV各分离物之间亲缘关系非常近,而与Fijivirus其他成员亲缘关系较远,原核表达获得的融合蛋白为靶标蛋白。

南方水稻黑条矮缩病毒S9基因RNA干涉载体的构建

[目的]构建抗南方水稻黑条矮缩病毒(Southern Rice Black-Streaked Dwarf Virus)的RNA干涉载体。[方法]通过PCR扩增、克隆并测序获得SBRSDV病毒S9基因的703 bp片段,与其他地方分离物S9序列的同源性高达99%,将此片段连接至p DS1301上,并对阳性克隆进行菌落PCR、酶切等验证。[结果]成功构建了可以用于转化水稻产生转基因植株的抗SBRSDV病毒的RNAi载体。[结论]利用SBRSDV病毒S9基因的部分片段构建了p DS1301-S9 RNA双链干涉载体,为创建水稻抗SBRSDV新种质奠定了基础。

南方水稻黑条矮缩病毒传播介体白背飞虱带毒率监测情况初报

南方水稻黑条矮缩病是我国新发生的病毒病,主要通过白背飞虱传播。广西迁入性白背飞虱数量大,4月13日-6月23日样本检测,带毒率最高达80%。平均带毒率8.18%。白背飞虱带毒情况及发生数量成为广西南方水稻黑条矮缩病发病流行的重要因素。本文就广西白背飞虱带毒率监测情况进行了小结,提出加强白背飞虱带毒率监测做好南方水稻黑条矮缩病早期预警和防控的建议。

南方水稻黑条矮缩病毒江西分离物CP基因克隆及序列分析

根据GenBank已登陆的SRBSDV S10核苷酸序列设计引物,克隆SRBSDV江西分离物外壳蛋白(CP)基因,结合已公布的序列,通过生物信息学方法进行序列分析。结果表明,SRBSDV江西分离物CP基因全长1 674个核苷酸,推测编码557个氨基酸,与已报道的SRBSDV CP基因之间核苷酸同源性为97.5%～100%,氨基酸同源性为97.7%～100%。SRBSDV CP基因核苷酸序列高度保守,保守位点占全部位点的83.5%。没有发现重组事件。本研究首次报道根据系统发育进化树,SRBSDV可分为2大组群,不存在明显的地域和寄主分化。

南方水稻黑条矮缩病发生特点及危害趋势分析

南方水稻黑条矮缩病是一种严重的病毒病,该病毒主要侵染禾本科水稻、小麦、玉米、高粱。其病毒的传播途径主要是白背飞虱。本文主要针对水稻新病害南方水稻黑条矮缩病发生特点及危害趋势进行分析。首先阐述了病害症状、病原病毒及寄主范围。然后分析了南方水稻黑条矮缩病的发病特点和发展趋势。最后提出了南方水稻黑条矮缩病防治对策,包括生态防治、物理防治和综合防治。未来该病害发生的趋势依然严峻,因此需要采取有效的防治措施。