硫酸铵-丙酮协同沉淀法纯化南极假丝酵母产脂肪酶

采用硫酸铵-丙酮协同沉淀法,对南极假丝酵母产脂肪酶(CALB)进行了分离纯化研究。经正交实验确定纯化工艺为:向酶液中加入硫酸铵至饱和度45%的同时加入0.3倍酶液体积的丙酮;离心后再向上清液中加入硫酸铵至饱和度75%,分相后,相界面处沉淀即为脂肪酶粗品。经分离纯化后,酶活回收率为54%、纯化倍数为2.72。

南极假丝酵母产脂肪酶在15L发酵罐中培养条件的研究

对15 L发酵罐中南极假丝酵母(C.antarctica DSM3855)的发酵工艺条件进行了研究,确定了最适的产酶工艺条件:搅拌速度为300 r.min-1,通气量为10 L.min-1,接种量为10%,添加GPE作为消泡剂。在此培养条件下,培养54 h产酶达到高峰值,最高酶活力达到19.3 U.mL-1。

产甘油假丝酵母25S rRNA甲基转移酶BMT5对乙酸胁迫耐受的影响及应用

挖掘功能基因,提升菌株环境胁迫耐受性,对高效利用纤维素水解液产乙醇至关重要。产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是具有多重抗逆性的工业菌株,经基因组文库筛选,获得能够提高酵母乙酸耐受性的rRNA甲基转移酶基因CgBmt5。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达CgBmt5提高了乙酸耐受性,重组菌在胁迫下乙醇产量为60.5 g/L,提高17.7%。在C.glycerinogenes中过表达CgBmt5后,乙酸胁迫下乙醇产量提高17.6%,2种过表达的单位菌体产量、底物转化率、生产强度均有提高。进一步将C.glycerinogenes过表达菌应用于纤维素水解液发酵,乙醇产量提高71.7%,转化率提高65.0%,生产强度提高155.7%。乙酸胁迫下,过表达菌中脂质过氧化水平降低,且过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性增加;转录分析发现,Pfk1和Arg3基因上调,Gpd1和Cox3下调,表明CgBmt5可能通过降低脂质过氧化水平、提高SOD和CAT活性及影响糖代谢和精氨酸合成促进菌株的乙酸耐受和胁迫下的发酵能力。该研究为酵母的胁迫耐受机制和纤维素乙醇技术发展提供了新的生物材料。

南极假丝酵母生产脂肪酶发酵条件研究

用南极假丝酵母(C. antarctica DMS 3855)发酵生产胞外脂肪酶。通过摇瓶和15 L发酵罐发酵实验,研究了培养基成分和操作条件,得到较优的培养基组成和发酵生产的工艺条件。在培养基组成:豆粉40 g·L-1,淀粉15 g·L-1,豆油5 mL·L-1等;操作条件:温度24 ℃,初始pH6 0,通气量10 0 L·min-1,发酵周期缩短到54 h。由15 L发酵罐生产酶液的酶活达到19 2 U·mL-1。

南极假丝酵母诱变育种及产脂肪酶条件优化

通过紫外诱变、硫酸二乙酯诱变及复合诱变,对南极假丝酵母菌种进行了选育,筛选出一株高产菌株UDAan-1,其酶活达到42.7 U.mL-1,为原始菌株的1.8倍。在摇瓶条件下对发酵培养温度、初始pH值等南极假丝酵母诱变菌株产酶工艺参数进行了优化。最终确定了各发酵工艺参数:培养温度26℃,初始pH值6.5,发酵用菌种培养20h,接种量6%(体积分数),摇床转速200 r.min-1,250 mL摇瓶装液量50 mL,表面活性剂选用0.1%吐温-80(体积分数)。

产朊假丝酵母发酵蛋白桑的培养基优化

以蛋白桑桑叶为研究对象,利用产朊假丝酵母菌进行培养料发酵试验。根据单因素试验结果,设计并实施了葡萄糖、磷酸二氢钾(KH2PO4)、硫酸铵[(NH4)_(2)SO_(4)]、硫酸镁(MgSO_(4))、蒸馏水五因素四水平的正交试验,发酵后测定了产朊假丝酵母菌的菌数,确定了最佳的培养基配方,即1.2 g葡萄糖、0.025 g KH2PO4、0.05 g(NH4)_(2)SO_(4)、0.001 g MgSO_(4)、16 mL蒸馏水。在此培养基中,产朊假丝酵母菌能以菌数多达10.05亿/g进行生长繁殖。

磁性壳聚糖纳米复合材料固定化褶皱假丝酵母脂肪酶催化合成木质甾醇酯

以磁性壳聚糖纳米复合材料共价固定的褶皱假丝酵母脂肪酶为催化剂,以木质甾醇和油酸为原料,对木质甾醇油酸酯的酶法合成工艺条件进行了优化。得到的最佳工艺条件为:催化剂用量12.7%(以底物总质量计),油酸与木质甾醇物质的量比为2∶1,木质甾醇质量浓度为122.9 g/L,反应温度50℃,反应时间24 h。在该条件下,木质甾醇转化率为96.42%。对月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸不同碳链长度的脂肪酸或混合脂肪酸进行酯化反应,木质甾醇的转化率可达96.67%~98.74%,催化剂使用5次时,转化率仍可达82.45%。

南极假丝酵母脂肪酶B的酿酒酵母表面展示及其催化己酸乙酯的合成

从南极假丝酵母(Candida antarctica)基因组克隆得到南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica Lipase B,CALB)全基因片段,利用连接肽celA Linker将CALB与酿酒酵母细胞表面展示蛋白α-凝集素的C端连接融合,构建表面展示载体pICAS-celAL-CALB,转化酵母后获得重组酵母菌Saccharomyces cerevisiae pICAS-celAL-CALB。该重组酵母菌经葡萄糖诱导表达及分析,表明CALB已在酿酒酵母细胞表面成功展示,水解活力达26.26 u/(g·dry cell)。重组酵母菌经冻干能有效地实现在非水相中全细胞催化己酸和乙醇酯化合成己酸乙酯。反应物己酸与乙醇的摩尔比为1:1.25,己酸乙酯的产率为98.0%,具有较好的操作稳定性。

产脂肪酶假丝酵母的筛选及其研究

从武汉油污样中分离获得一株高产脂肪酶的假丝酵母R 2 .发酵研究表明 ,最适培养基为蛋白胨2 0 g/L,蔗糖 10 g/L ,橄榄油 5 g/L ,(NH4 ) 2 SO4 1g/L ,MgSO4 ·7H2 O 1g/L ,K2 HPO4 1g/L和吐温 80 1g/L ;最适产酶条件为 30℃ ,初始 pH7.0 ,转速 2 0 0r/min ,培养 32h .最高产酶活力达到 1437u/mL ,酶作用最适温度40℃ ,最适 pH7.5 .

酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的酶学性质研究

本文对酿酒酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)的一般酶学性质进行研究,得出如下结论:酵母表面展示CALB在碱性条件下具有很好的稳定性和水解活性。其水解对硝基苯酚酯的最适反应pH值范围是8.0～8.5,与游离的CALB商品酶相比,向碱性条件偏移。最适反应温度范围是40～45℃。最适反应底物为对硝基苯酚丁酸酯,表现出极为明显的底物特异性。Ca2+、Mg2+对其有明显的激活作用。K+对其有微弱的激活作用。而Co2+、Cu2+对其有明显的抑制作用。本研究为酵母表面展示脂肪酶的应用研究奠定理论基础。

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母的表达及酶学性质研究

为提高南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase B,CALB）的表达量,根据毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子偏好性设计合成CALB基因,插入表达载体pPIC9K构建重组质粒pPIC9K-CALB.重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过G418抗性筛选得到多拷贝转化子.摇瓶发酵120 h后上清液酶活力达到46 U/mL,通过金属螯合层析纯化发酵液将CALB纯化了5.23倍,比活力达到856.7 U/mg,去糖基化实验显示重组CALB比野生型CALB大5 ku.实验考察了不同反应温度、pH值和金属离子对重组CALB活性和稳定性的影响,发现重组CALB最适反应温度和pH分别为30℃和6.5,在pH 5.0~8.0之间以及40℃以下有较好稳定性,金属离子（10 mmol/L）Ca2＋,Zn2＋,Mn2＋有助于CALB酶活力的提高,而Cu2＋,Ag＋,Fe3＋强烈抑制酶催化反应.

粗状假丝酵母产脂肪酶发酵条件的优化

利用粗状假丝酵母发酵生产脂肪酶,通过对粗状假丝酵母胞外脂肪酶发酵过程的培养基和发酵培养条件的优化,得出产脂肪酶的最佳条件:碳源为聚乙烯醇乳化的橄榄油和葡萄糖,氮源为蛋白胨和尿素,酵母浸出液4.5g/L,MgSO4.7H2O0.4g/L,K2HPO43.5g/L;反应温度30℃,培养基初始pH7.0,接种量为10%,摇床转速180r/min,培养24h。在此发酵条件下,发酵液的最高酶活达到12U/mL。

南极假丝酵母脂肪酶发酵条件优化及酶学性质

分别用摇瓶和15L发酵罐,对南极假丝酵母产胞外脂肪酶的培养基成分和操作条件进行了实验研究。得到最优的培养基组成为:豆粉40g／L,淀粉15g／L,豆油5mL／L,K2HPO4g／L,MgsO4·7H2O1g／L,Tween-800.1％,酵母膏5g／L;操作条件为:温度24℃,初始pH值为6.0,通气量为10.0L／min。在此培养条件下,发酵周期缩短至54h。由15L发酵罐生产的酶液酶活达到19.2U／mL。酶液在pH值为4.0～6.0和7.5～9.0范围内较稳定,其最适宜pH值范围为6～8.5;70℃时酶的催化活性最大.在40～70℃的温度范围内保持1h后残留酶活为60％。

南极假丝酵母脂肪酶B在毕赤酵母中的分泌型表达及酶学性质初探

将南极假丝酵母脂肪酶B（CALB）基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA（含pAOX1启动子）和pGAPZαA（含pGAP启动子）中,转入毕赤酵母表达宿主KM71H,经三丁酸甘油酯平板活性筛选获得高效表达的酵母工程菌株.分泌型表达CLAB酵母工程菌的酶活较高,经摇瓶发酵96 h后,CLAB活力达到11.1 U/mL.经发酵罐高密度发酵84h后,CLAB活力达到179.2 U/mL,蛋白质量浓度为1.36 mg/mL.体积分数12％SDS-PAGE凝胶电泳显示重组CALB相对分子量为36 kDa.该酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0.在pH7.5 -9.5较稳定,经55℃保温1h,残余酶活还有48.5％.5 mmol/L Mg^2＋、Ni^＋、Co^2＋和体积分数0.10％ SDS对CALB酶活影响很小,而Zn2强烈抑制酶催化反应,体积分数0.05％ Triton X-100对CALB稍有激活作用。

南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A在毕赤酵母中的表达、纯化及性质

将编码南极假丝酵母脂肪酶A的基因进行克隆,与pPIC9K连接构建成重组载体,并将其电转化入毕赤酵母GS115中。通过MD和MM平板及PCR扩增,筛选和鉴定重组子。重组细胞经过120 h培养后,发酵液上清酶活达到13 U/mL。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示,重组脂肪酶分子量约为50 kD,比原始脂肪酶略大。粗酶液经中空纤维素膜超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀和离子柱交换层析后,得到在SDS-PAGE上显示为单一条带的重组脂肪酶。该酶最适反应温度为75℃,在70℃保持30 min后,仍具90%以上的活性,最适反应pH值为7.0,在pH6.0～8.0的范围内,具有一定的稳定性。

粗状假丝酵母(Candida valida T2)生产脂肪酶的发酵条件

对粗状假丝酵母产生脂肪酶的培养条件进行了研究。结果表明,该菌株产脂肪酶的适宜培养基组成为:桐油15mL/L,黄豆粉30g/L,糊精10g/L,硝酸铵10g/L,MgSO4·7H2O1g/L,K2HPO42g/L,Tween800.5g/L;最佳培养为温度30℃、发酵液起始pH6,摇瓶发酵脂肪酶活力达到1467U/mL。

表面展示南极假丝酵母脂肪酶B的毕赤酵母FM22发酵培养基响应面优化

FM22培养基以丰富的氮源、较强的适应性等优势,适用于毕赤酵母发酵。为进一步对毕赤酵母发酵表达南极假丝酵母脂肪酶B进行优化,选取培养基中对其影响较大的CaSO4、KH2PO4、(NH4)2SO4、PTM4为自变量,酶活力为响应值。通过单因素试验得自变量最佳值及高低水平,再采用Box-Behnken组合设计方法,模拟二次多项式回归方程的预测模型,研究各自变量及其交互作用对酶活力的影响。最终得到自变量最佳值:KH2PO445.02g/L、(NH4)2SO45.63g/L、CaSO40.46g/L、PTM4 1.63mL/L,酶活力为3214.7U/gDCW,较优化前提高约40%。

聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Candida valida T2)细胞的研究

对聚氨酯泡沫固定产脂肪酶粗状假丝酵母(Candida valida T2)细胞的固定化条件进行了研究。实验结果表明,聚氨酯泡沫颗粒经密度和粒径筛选,酸碱处理,以及固液比优化,载体固定细胞干质量比达到1 571 mg/g,细胞脂肪酶的酶活为每克干细胞1 415 U。电镜图片显示粗状假丝酵母菌(Candida validaT2)在载体孔隙内和脊壁上缠绕充盈,生长良好,固定结构稳定。固定化细胞连续催化水解桐籽油5批次,细胞相对水解酶活保持率达73%,固定细胞的损失率为12.5%。固定化细胞颗粒显示出良好的操作稳定性和酶活保持率,为进一步的应用研究提供了实验基础。

南极假丝酵母脂肪酶B的固定化及其在合成维生素A棕榈酸酯中的应用

从10种树脂中筛选出3种固定化效果较好的树脂ECR1030M、LX-1000EP和MC150EP,优化南极假丝酵母脂肪酶B的固定化方法。其物理吸附法固定化的最佳参数为:介质为p H 8.0或6.0的Na_2HPO_4-柠檬酸缓冲液,18 g/L酶液和树脂按20∶1(V/W)比例混合,30℃、180 r/min固定化3 h,应用于维生素A棕榈酸酯合成研究,所得固定化脂肪酶的酯化比酶活分别为1 055.7 U/g(ECR1030M树脂)、1 077.0 U/g(LX-1000EP树脂)和1 024.3 U/g(MC150EP树脂),同时对固定化酶的性质进行了研究,其中,ECR1030M树脂固定化酶表现出更好的操作稳定性,重复使用7个批次反应后,固定化CALB的残余酶活90%以上,维生素A棕榈酸酯的产率达85%以上。

假丝酵母(Candidasp.Jw4)的产脂肪酶条件及脱脂能力

从采集的家庭污水样品中 ,分离筛选出一株暂定名为假丝酵母 (Candidasp .Jw4 )的菌株 .该菌株在含油的筛选琼脂平皿上生长良好 ,具有丰满的假菌丝 .最佳产酶条件是 :发酵培养基 (g/L)为菜籽油 30 ,玉米浆 30 ,酵母粉 2 ,K2 HPO4 5 ,MgSO4 ·7H2 O 1和CaCl2 0 .2 ,pH 6 .5 ,2 8℃ .Jw4脂肪酶活力最适温度为4 2℃、最适 pH 8.2 .Jw4既可利用植物油也可降解动物油 .在菜籽油 (皂化值 174 .74 )为 2 5 0 g/L或猪油 (皂化值 185 .10 )为 2 5 0 g/L的反应液中 ,加入粗酶液 ,分别使反应液酶浓度为 10u/mL和 2 0u/mL ,pH 8.0～8.2 ,4 0℃通气振荡 12 0h ,菜籽油和猪油分别脱脂达 80 %和 73% .