环境因子对南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13多糖合成关键酶UGD基因表达的影响

以南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13为材料,采用实时定量PCR的方法研究了温度、冻融循环及培养基中NaCl、葡萄糖含量和pH对多糖合成关键酶基因ugd表达水平的影响。结果表明,低温有利于ugd的表达,在2℃和10℃培养温度下,培养24h后ugd的表达量约为20℃时的4倍;冻融循环后,ugd的表达量上调,第2个冻融循环后ugd的表达量较对照提高了6.85倍;NaCl对ugd的影响表现为低促高抑,即NaCl含量为6.0%时ugd的表达量是对照(3.0%)的3.97倍,但含量达9.0%时ugd表达量仅为对照的2/5;葡萄糖能够提高ugd的表达量,当含量为2.0%时ugd表达量为对照的13.68倍;在一定范围内(pH5.0—8.0),pH的改变会促进ugd的表达,当pH为6.0时ugd表达量约为pH7.0时的2.15倍。

南极菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13引导糖基转移酶基因表达对环境因子变化的响应

为了探讨胞外多糖在南极微生物低温适应性中的作用与机制,克隆了南极菌Pseudoaltero-monas sp.S-15-13的引导糖基转移酶(GTF)核心片段,并采用Real-Time PCR的方法研究了温度、冻融循环、盐浓度、pH等条件对该糖基转移酶基因(gtf)表达的影响。结果表明,低温有利于gtf的表达,短时的低温刺激(2℃)1h后,gtf的表达量即上调为对照的1.5倍;而该菌经4和10℃培养24h后gtf的表达量约为20℃时的8～12倍;经过冻融循环gtf的表达量上调,在第2个冻融循环后gtf的表达量较对照提高了3.667倍;盐浓度对gtf的影响表现为低促高抑,即NaCl含量为6.0%时gtf的表达量是对照(3.0%)的3.59倍,当NaCl含量达9.0%时gtf表达量则显著下调;在一定范围内(pH5.0～8.0),pH的改变会促进gtf的表达,当pH为6.0时gtf表达量约为pH7.0时的2倍。该结果为探讨胞外多糖在南极微生物环境适应性中的作用与机制提供了科学依据。

响应面法优化产琼胶酶南极菌Pseudoalteromonas sp.NJ21的发酵条件

采用响应面法对1株高产琼胶酶的南极海冰菌Pseudoalteromonas sp.NJ21的发酵条件进行优化。首先分别以温度、pH、不同碳源、不同氮源、不同金属离子作为唯一变量进行单因素实验,筛选出对酶活有显著影响的单因素取值范围;参考单因素实验结果,采用Plackett-Burman实验设计筛选出影响酶活主要因素,再利用Box-Behnken设计及响应面分析法进行回归分析以确定最佳发酵条件。结果表明,D-甘露糖、蛋白胨、CaCl2和培养温度与酶活存在着显著的相关性,通过求解回归方程得到Pseudoalteromonas sp.NJ21的最佳培养基组成为D-甘露糖5.52g/L;蛋白胨7.4g/L;CaCl25.84mmol/L;最佳发酵温度为15℃;优化后发酵液中琼胶酶酶活由3.5U/mL提高到25.76U/mL,比优化前提高了6.36倍。

南极适冷菌Pseudoalteromonas sp. S-15-13胞外多糖的分离、纯化和结构分析

从一株南极海冰中分离出来一种适冷菌Pseudoalteromonas sp. S-15-13,其胞外多糖具有良好的免疫活性.为了探讨南极菌S-15-13胞外多糖结构与功能之间的相互关系,对其胞外多糖进行了分离纯化和结构分析.粗多糖经DEAE-Sephadex A-50离子交换层析及Sephadex G-100凝胶层析纯化后得到组分EPS-Ⅱ,经HPLC分析验证EPS-Ⅱ为单一组分,其分子量为62000;单糖组成、甲基化分析及核磁共振结果表明,EPS-Ⅱ的主体结构由(1,2)α-D-Man组成主链,并在6位上有分支的新甘露聚糖.

南极适冷菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13胞外多糖EPS-Ⅱ对小鼠S_(180)肉瘤抑制作用的研究

目的研究南极适冷菌Pseudoalteromonas sp.S-15-13胞外多糖EPS-Ⅱ的抑瘤作用。方法不同浓度的EPS-Ⅱ腹腔注射于荷S180肉瘤小鼠,通过荷瘤小鼠的脾重和瘤重变化来测定EPS-Ⅱ的抑瘤效果;采用免疫组化方法,测定荷瘤小鼠增殖细胞核抗原(PCNA),三联组氨酸(FHIT)和S-100蛋白阳性表达的情况。结果(1)不同剂量的EPS-Ⅱ均具有提高荷瘤小鼠脾脏重量,有效抑制肿瘤生长的作用,最高抑瘤率可达45.1%。(2)免疫组织化学结果表明,不同剂量的EPS-Ⅱ均能抑制PCNA表达,促进FHIT和S-100蛋白表达的作用。结论南极适冷菌S-15-13胞外多糖EPS-Ⅱ可能通过调节PCNA,FHIT和S-100的表达来发挥抑瘤作用。

发酵南极磷虾粉对锦鲤生长性能、血清生化指标、肠道结构及菌群的影响

【目的】为进一步挖掘南极磷虾(Euphausia superba)粉作为水产饲料优质蛋白源的利用价值,探讨发酵南极磷虾粉对锦鲤(Cyprinus carpio)生长性能、血清生化指标、肠道结构及菌群的影响。【方法】以初体质量(4.92±0.22)g的450尾锦鲤为研究对象,将其随机分为5个组,每组设置3个重复,每个重复30尾鱼。其中对照组添加200 g/kg未发酵的脱脂南极磷虾粉,实验组添加200 g/kg由粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)和其三者复合菌(质量比1∶1∶1)发酵的脱脂南极磷虾粉,分别命名为A(对照组)、B、C、D和E组。投喂共计70 d,然后测定锦鲤的生长性能、血清生化指标、肠道结构及肠道菌群。【结果】1)实验组锦鲤的末体质量、特定生长率和增重率均显著高于对照组(P<0.05),其中E组的生长性能显著高于其余各实验组(P<0.05)。2)实验组血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)活性显著提高(P<0.05)。3)肠道组织学发现,各实验组锦鲤肠道肌层厚度和绒毛高度均于对照组,并且各组肠道健康状况较为一致,未发现明显损伤。4)肠道菌群研究结果显示,实验组Chao1指数、香农指数(Shannon)和辛普森指数(Simpson)均有不同程度的提高。在门水平上,各组共有的优势菌群有梭杆菌门(Fusobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)、软壁菌门(Tenericutes)、厚壁菌门(Firmicutes)和放线菌门(Actinobacteria)。在属水平上,优势菌群有鲸杆菌属(Cetobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、气单胞菌属(Aeromonas)。实验组锦鲤肠道内有益菌分布比例(鲸杆菌属和拟杆菌属)有所提高,有利于肠道菌群的稳定和肠道健康。【结论】在脱脂南极磷虾粉添加水平为200 g/kg的锦鲤饲料中,使用复合菌[m(粪肠球菌)∶m(植物乳杆菌)∶m(丁酸梭菌)=1∶1∶1]对磷虾粉进行发酵,更有利于锦鲤的生长。

产絮凝剂菌株Pseudoalteromonas undina JP的表型特征及基因组学分析

从菲律宾蛤仔黏附污泥中分离到1株絮凝率高达80.0%的高絮凝活性菌株JP,结合其序列比对和生理生化指标结果,菌株JP被鉴定为Pseudoalteromonas undina。通过Illumina测序平台对菌株JP进行基因组框架序列扫描测序,获得20个总长度为4046116 bp的框架序列,在这些框架序列中共预测到14个rRNA、87个tRNA和3746个基因,注释结果表明其主要参与肽聚糖、脂多糖、氨基糖、核苷酸糖、淀粉、蔗糖、果糖、甘露糖的生物代谢。产胞外多糖类絮凝剂代谢途径中关键前体、重复寡糖单元和调控基因均有发现,虽未找到eps基因簇,推测其可能具有与eps基因簇相似的基因承担对应的功能。

基于基因组学分析Pseudoalteromonas paragorgicola GHS18菌株产絮凝活性物质基础

从天然生物絮凝剂资源菲律宾蛤仔黏附污泥中分离获得1株新的高絮凝活性菌株GHS18,絮凝率为75.1%。综合序列比对和生理生化特征结果,GHS18被鉴定为Pseudoalteromonas paragorgicola。通过Illumina测序平台对菌株GHS18进行全基因组框架扫描测序,基于基因组的分子水平来探索菌株GHS18产絮凝活性物质的基础。生物信息学分析结果表明菌株主要参与淀粉、蔗糖、果糖、甘露糖、半乳糖、氨基糖、核苷酸糖、肽聚糖、脂多糖的生物合成与代谢,具有絮凝多糖合成途径中重要的前体底物(UDP-Glucose、GDP-mannose和UDP-glucuronate)和重复寡糖单元(UDP-Gal、dNTP-D-Glu、dNTP-L-Rham、UDP-3-O-(3-acetyl)-GlcNAc),将重复寡糖单元聚合成多糖的eps基因簇并未发现,推测其具有类似的基因簇代替行使功能。本研究为未来开发该菌株为发酵产品提供了一定的理论依据,也为更进一步的研究奠定了基础。

南极微生物产低温蛋白酶菌株的筛选、分子鉴定及部分酶活特性

从南极获得的260株低温细菌中筛选到107株具有蛋白酶活性菌株,其中5株菌所产蛋白酶的活性高于45U/mL。对其进行16SrRNA基因序列的同源性和系统发育分析,结果表明,菌株NJ276、NJ59、NJ1670、NJ345属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas),NJ341属于科尔韦尔氏属(Colwellia)。对其中NJ276、NJ341、NJ1670、NJ345这4株产蛋白酶南极嗜冷菌的生长及分泌蛋白酶的部分酶活特性进行研究,结果表明:(1)4株菌最适生长、产酶温度均为10℃左右;培养2～5d,嗜冷菌生长、产酶量一直处于较高的状态。(2)4株南极嗜冷菌分泌的蛋白酶的酶活反应最适pH值为9。(3)菌株NJ276、NJ59分泌的蛋白酶最适酶活温度为50℃;菌株NJ341、NJ345分泌的蛋白酶最适酶活温度为40℃;在0℃时蛋白酶活性是最高活性的30%左右,蛋白酶热稳定性较差,因此菌株NJ341、NJ345分泌的蛋白酶属于低温蛋白酶。

南极磷虾酶解多肽的抑菌活性

选用复合酶酶解南极磷虾,对酶解多肽进行多肽含量及相对分子质量分布测定。采用滤纸片法筛选南极磷虾酶解多肽及各分级级分对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、四联微球菌、大肠杆菌、啤酒酵母和副溶血弧菌6种菌的抑菌活性。结果表明,该法所得的南极磷虾酶解多肽的含量达81.44%,相对分子质量范围为254~10 000;酶解多肽对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌活性,且分级级分Ⅲ（1.0×103〈Mr〈3.0×103）的抑菌效果明显优于其他级分。

基于高通量测序的冷冻南极磷虾中细菌菌群结构分析

目的分析冷冻南极磷虾中总细菌菌群和可培养细菌菌群的结构特征。方法提取冷冻南极磷虾中宏基因组,通过高通量测序技术进行总细菌菌群分析;提取冷冻南极磷虾中可培养细菌菌落的总DNA,通过高通量测序技术进行可培养细菌菌群分析。结果冷冻南极磷虾中总细菌菌群多样性丰富,相对丰度大于1%的包括芽孢杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、克罗诺杆菌属(Cronobacter)、嗜碱菌属(Alkaliphilus)、八叠球菌(Sarcina)、乳球菌属(Lactococcus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、土壤杆菌属(Sediminibacterium)、未分类菌(unclassified)、罗尔斯顿菌属(Ralstonia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)以及苯基杆菌属(Phenylobacterium),占总量的85.04%。冷冻南极磷虾中可培养的细菌种类少,主要包括假交替单孢菌属(Pseudoalteromonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)和嗜冷单胞菌属(Psychromonas),相对丰度分别为64.43%、33.47%和1.75%。可培养细菌中占优势的假交替单孢菌属、嗜冷杆菌属和嗜冷单胞菌属仅占总细菌菌群的1.10%。结论本研究初步揭示了南极磷虾细菌菌群的多样性和相对丰度,为进一步研究微生物与南极磷虾品质的相关性奠定基础。

南极土壤芽孢杆菌的分离鉴定及其防治玉米细菌性褐腐病的研究

[目的]本研究旨在从南极土壤中筛选防治玉米细菌性褐腐病的芽孢杆菌菌株,为该病害的防治提供菌株资源。[方法]从南极长城站地震台附近的企鹅聚居地土壤中分离芽孢杆菌。结合16S rDNA及gyr B基因序列对分离到的芽孢杆菌进行鉴定。借助平板抑菌试验筛选对玉米细菌性褐腐病病原菌具有拮抗效果的生防芽孢杆菌。通过田间防治试验,筛选具有较好生防效果的芽孢杆菌。利用MALDI-TOF-MS对芽孢杆菌产生的抗菌物质脂肽化合物进行鉴定。[结果]通过16S rDNA及gyr B基因序列对分离自南极的23株芽孢杆菌进行鉴定,其中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)9株,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)14株。借助平板抑菌试验,筛选获得抑菌效果明显的2株B.amyloliquefaciens菌株EZ15-07、EZ15-09和2株B.licheniformis菌株EZ01-05、EZ15-08。田间试验结果表明,菌株EZ15-07和EZ01-05对玉米细菌性褐腐病的防治效果分别为59.3%和55.3%。对这2个菌株发酵液的MALDI-TOF-MS检测表明,菌株EZ15-07能产生Surfactin和Bacillomycin D 2种脂肽化合物,菌株EZ01-05能产生Bacillomycin D和Fengycin 2种脂肽化合物。[结论]由南极土壤分离获得的菌株EZ15-07和EZ01-05对玉米细菌性褐腐病防治效果显著,2个菌株均具有较好的田间应用潜力。

南极芽孢杆菌Bacillus sp.107生长特性及抑制植物病原真菌的研究

从南极海泥中筛选获得对植物病原真菌有抑制作用的芽孢杆菌Bacillussp.107,以常见植物病原真菌为主要指示菌,测定菌株发酵上清液的抑菌谱;研究温度、NaCl质量分数和初始pH值对其生长和抑菌活性的影响,并测定菌株发酵液对黄瓜白粉病的防治作用。结果表明,芽孢杆菌Bacillussp.107发酵上清液对常见植物病原真菌尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、茄交链孢菌（Alternaria solani）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）和辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）均有抑制作用。产抑菌物质的适宜培养条件：温度为15~30℃,NaCl质量分数为0%~4.5%和初始pH值为5.0~9.0;当NaCl质量分数为3.0%,温度为25℃,初始pH值为7.0时抑菌活性最高。芽孢杆菌Bacillussp.107发酵液的5倍稀释液对黄瓜白粉病的防效达62.05%。该菌株在植物病害的生物防治中,具有潜在的应用价值。

南极石油烃降解嗜冷菌的筛选及其降解特性的研究

从385株南极海洋细菌中筛选出2株石油烃降解菌NJ276和NJ341,并对其降解特性进行了初步研究。以柴油为唯一碳源进行降解实验的结果表明,它们在5℃时20 d内对柴油的降解率分别达到23.47%和32.15%,在15℃时20 d内降解率分别达到43.95%和62.47%,其降解能力随着培养温度的升高而显著增强;石油烃降解残油组分的GC-MS分析结果表明,柴油经过嗜冷菌NJ276降解后的残油组分中能检测到C15～C21七种烷烃,经过嗜冷菌NJ341降解后的残油组分只能检测到少量C16,C17和C18三种烷烃。对它们进行16S rDNA基因序列的同源性和系统发育分析结果表明,菌株NJ276属于假交替单胞菌属(Pseudoaltero monas),菌株NJ341属于科尔韦尔氏属(Colwellia)。

4种南极冰藻中抗紫外辐射活性化合物类菌胞素类氨基酸(MAAs)的初步研究

目的研究和发现极端环境下南极冰藻中抗紫外辐射活性化合物。方法对4种生长较快的南极冰藻进行低温光照培养,同时采用UV-A和UV-B辐照胁迫,提取分离抗紫外辐射活性化合物;根据其理化性质、仪器分析数据初步确定各化合物的分子结构。并通过日光辐照活性组分,观察其降解速度,确定其抗紫外辐射活性。结果从南极绿藻Chlorophyceae L-4,硅藻Diatom HF-9中分别得到5种、7种活性化合物,其中6种属于类菌胞素类氨基酸(MAAs)类物质,并具有较强的抗紫外辐射活性。结论MAAs类物质在南极冰藻抗强紫外辐射过程中扮演重要角色。

南极产低温几丁质酶菌株的筛选及分子鉴定

从南极普里兹湾深海底泥样品中分离得到一批嗜冷细菌,对这些嗜冷细菌进行了产几丁质酶菌株的筛选,对其中一株具有较高产酶活性的菌株AC167所分泌的几丁质酶进行了性质分析,并通过16S rDNA序列分析进行了菌株的分子鉴定。该菌株最适生长温度为10℃,最高生长温度为25℃,是典型的嗜冷菌,经16S rDNA序列比较及系统发育分析鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。该菌株只在低于25℃的条件下分泌几丁质酶,酶的最适反应温度为30°C,属于低温酶。

南极放线菌NJ-F2萃取物的抗菌活性初步研究

从南极第24次科学考察采集的海泥样品中分离获得放线菌NJ-F2,对NJ-F2发酵液的乙酸乙酯萃取物进行体外抗菌实验,并采用16S rDNA方法对NJ-F2进行系统发育分析。结果表明萃取物对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)分别为0.25 mg/mL,5.0 mg/mL;而对大肠杆菌和产气杆菌的MIC、MBC分别为0.5 mg/mL,5.0 mg/mL,但对真菌没有抗菌作用;16SrDNA分析结果表明NJ-F2为链霉菌属(Streptomyces sp.)。

影响南极海洋石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49生长和降解率的环境因素研究

以柴油为唯一碳源和能源,从南极海水海冰微生物资源库中筛选到一株石油烃低温降解菌希瓦氏菌NJ49,并对影响其生长和降解率的环境因素(pH、温度、盐度、营养盐和表面活性剂)进行了初步研究。结果表明:希瓦氏菌NJ49可作为低温海域石油烃污染生物修复的菌源,其生长和降解的最适条件为:初始pH7.5,温度15℃,盐度6%,摇瓶装量80ml,最佳氮源硝酸铵,最佳磷源为磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物,添加表面活性剂可促进希瓦氏菌NJ49的生长和生物降解率。

产生抗肿瘤抗生素Sandramycin的南极放线菌C_(3905)

从南极乔治王岛土壤分离到一株诺卡氏菌形放线菌C390 5菌株。其气生菌丝白色 ,基内菌丝无色至乳脂或浅粉 ;菌丝直径 0 5～ 0 8μm ,断裂为杆状和球状体 ,表面光滑。胞壁化学I型 ;无枝菌酸 ;磷酸类酯PI型 ;优势甲基萘酯为MK 9(H4)。DNA中G +C含量为 68 3～ 68 9mol%。兼性嗜冷 ,生长适温为 1 5℃～ 2 0℃。产生抗肿瘤抗生素sandramycin。基于以上特征及分子遗传分类的研究结果 ,我们建议C390 5菌株作为白色类诺卡氏菌的一个变种 ,命名为白色类诺卡氏菌南极变种 ,Nocardioidesalbusvar.antarcticus。

南极地区海底沉积物中低温菌的鉴定与生长温度特征

从南极半岛及舍得兰群岛海底沉积物的13个样品中分离到23株细菌,进行了0、5、10、15、18 20、25℃温度梯度培养试验及耐盐度试验。由生长温度曲线得知,其中15株菌在0℃生长,依据菌株不同,其最适生长温度范围均在5—20℃以内;25℃下生长明显下降(9株)或缓慢下降(6株),属于耐冷菌。经鉴定,假单胞菌11株;弧菌1株;芽孢杆菌2株及黄杆菌1株。这15株菌中2、11(均为假单胞菌)及15(黄杆菌)的最适生长温度均为5℃;且前两株菌对中温较敏感;10(假单胞菌);14(芽孢杆菌)的最适生长温度为10℃。本文还讨论了菌的分布与地区,以及与样点水源和距陆地远近间的相关性。