一步RT-PCR检测南芥菜花叶病毒方法的建立

本研究采用Trizol快速提取植物叶片总RNA ,通过GeneBank设计特异性引物 ,并利用一步RT PCR技术 ,最终建立了一套比较实用的检测ArMV的方法。该方法对于其它病毒的检测同样具有借鉴意义。

从进境水仙上检测出南芥菜花叶病毒

利用DAS-ELISA对从荷兰进口的6个品种的水仙种球进行检测发现,品种为Recurvus的水仙种球对ArMV的多抗血清呈阳性反应达85%。免疫吸附电镜观察到在感病水仙种球中存在直径约30nm的球状病毒粒子。根据ArMV外壳蛋白(CP)基因的保守序列设计引物,RT-PCR能从感病样品中扩增到预期580bp特异条带,序列测定分析表明此条带的序列为ArMV部分CP基因,在系统关系树上与ArMV的其它分离物形成一簇、亲缘关系很近,表明从进境水仙上检测到了ArMV。

郁金香种球传带南芥菜花叶病毒的检测

对从荷兰进口的郁金香种球进行检疫,应用培育长出的叶片作为检测材料,采用双抗夹心酶联免疫吸附测定方法(DAS-ELISA)和RNA逆转录PCR扩增法(RT-RCR)进行南芥菜花叶病毒的检测。从这些种球上发现了我国进境植物检疫二类危险性有害生物—南芥菜花叶病毒。

南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究

根据南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic Nepovirus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR检测引物,对南芥菜花叶病毒和非南芥菜花叶病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应。结果,南芥菜花叶病毒的感病植物组织的PCR产物均出现364bp的特异性扩增条带,而非南芥菜花叶病毒均未出现扩增条带,证明这对引物具有南芥菜花叶病毒鉴定特异性。将提取的南芥菜花叶病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系最低可检出南芥菜花叶病毒提取的RNA模板浓度为150pg/μL。

应用RT-Realtime PCR检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒不同分离物外壳蛋白(CP)基因的保守序列,设计合成引物和1条TaqMan荧光探针,建立了ArMV的反转录实时荧光PCR(RT-Realtime PCR)检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增,实现PCR扩增与探针检测同时进行,实验结果表明该方法具有"灵敏、准确、简便、快速"的特点,适合于口岸对南芥菜花叶病毒的快速检测。

进境百合种球南芥菜花叶病毒的检测及分子鉴定

本研究根据南芥菜花叶病毒(Arabismosaicvirus,ArMV)CP基因序列,设计并合成了特异性巢式PCR检测引物,通过第1轮RT-PCR和第2轮PCR扩增得到预期的930bp和260bp的条带,扩增序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在86%～97%的同源性.结果表明百合上分离到的病毒为ArMV,进一步研究也证明巢式PCR灵敏度与普通RT-PCR相比高出了103倍。

逆转录环介导等温扩增技术检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因序列设计并合成了2组RT-LAMP引物,通过筛选试验,最终确定Ar4组引物为最佳引物,建立了南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测方法。同时,通过实时浊度仪和钙黄绿素分别对检测结果进行了判断。特异性和灵敏度试验结果显示,RT-LAMP方法快速、特异且灵敏,其灵敏度与普通RT-PCR法一致。

南芥菜花叶病毒外壳蛋白的克隆表达及抗血清的制备

依据报道的ArMV外壳蛋白基因(coat protein,cp)序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到长约990bp的ArMV cp基因亲水基团部分片段,将目的片断克隆到原核表达载体pEGX-6p-1中,构建ArMV cp基因与GST蛋白融合表达载体pEGX-cp,重组载体化大肠杆菌BL21,经IPITG诱导后,融合蛋白GST-cp得到了特异表达。用12%的SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为63.2 kDa主要以包含体的形式存在。用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗体,免疫家兔后得到特异性较强的抗血清,经酶联免疫法检测效价为1∶100 000。

南芥菜花叶病毒高灵敏度检测方法的建立及应用

以感染ArMV的百合种球制备粗提液,分别用聚乙二醇(PEG-6000)和免疫磁珠(Immuno-magnetic beads,IMB)进行富集处理,以富集处理后的样品进行ELISA、RT-PCR和SYBR Green I实时荧光RT-PCR检测。结果表明:富集处理能显著提高这些方法从百合种球样品中检测ArMV的灵敏度。PEG-RT-PCR可检测稀释至10^(-5)的样品,IMB-RT-PCR可检测稀释至10^(-3)的样品。实时荧光RT-PCR检测也表明,PEG对百合种球中ArMV的富集效果优于IMB处理。对19批进境百合种球进行ArMV的RT-PCR检测,发现PEG或IMB富集处理提高了阳性样品的检出率。

进境唐菖蒲种球携带南芥菜花叶病毒的检测

利用DAS-ELISA对荷兰进境的唐菖蒲培育叶片进行南芥菜花叶病毒检疫,再对血清呈阳性的种球进行培育,以长出的叶片作为检测材料,采用RT-PCR方法进行南芥菜花叶病毒的检测,并对PCR产物进行克隆与测序。结果表明,从唐菖蒲种球上发现了我国进境植物检疫二类危险性有害生物南芥菜花叶病毒(Arabismosaic virus,ArMV)。

半巢式RT-Realtime PCR检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒(Ar MV)外壳蛋白(CP)基因的保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条Taq MAN荧光探针,建立了半巢式RT-Realtime PCR检测Ar MV的新方法。该方法有机地结合了巢式PCR和Taq MAN探针检测技术。第二步半巢式-RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。结果表明:该方法检测灵敏度可达0.06 fg/μL植物总RNA。

南芥菜花叶病毒衣壳蛋白的克隆、原核表达和多克隆抗体制备

为开发百合中南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)的血清学检测技术及研究ArMV的致病机理,原核表达ArMV衣壳蛋白(coat protein,CP),纯化并制备其多克隆抗体。以侵染东方百合杂交品种‘木门’(‘Conca D’or’)的ArMV基因组为模板,克隆ArMV CP基因全长,构建ArMV CP基因原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)原核表达ArMV CP蛋白,并以纯化ArMV CP蛋白为抗原制备兔抗多克隆抗体,Western blot鉴定多克隆抗体的特异性。结果表明:克隆获得百合ArMV CP序列(GenBank登录号:MT323117)全长,其长度为1515 bp,与已知的ArMV CP基因核苷酸序列相似性最高达到93.6%,氨基酸序列相似性最高达到98.2%;SDS-PAGE表明CP蛋白在E.coli BL21(DE3)中大量表达,蛋白相对分子质量为56 ku;Western blot结果显示抗体能够特异性结合ArMV CP蛋白,具有良好的特异性。

三抗体夹心酶联试剂盒中南芥菜花叶病毒阳性对照替代物研制

在研制的南芥菜花叶病毒三抗体夹心酶联(TAS-ELISA)检测试剂盒中,山羊抗鼠多克隆抗体能够起到很好的阳性对照作用,具有替代侵染性的南芥菜花叶病毒的功能,可以监控整个酶联反应体系是否正常工作,避免了检疫性南芥菜花叶病毒扩散到环境中去,通过分子生物学手段验证了研究的可行性。

南芥菜花叶病毒的RT-LAMP检测试剂盒的研制

南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus,ArMV）是我国对外公布的检疫性有害生物,其寄主广泛,极易传播、蔓延[1],因此,加强对该病毒的检测具有重要的意义。目前,针对ArMV的检测方法主要有DAS-ELISA和RT-PCR技术[2]。这两种方法在检测周期方面具有明显的优势,且操作简单,但对仪器的依赖性较强。

南芥菜花叶病毒的几种PCR检测方法的建立和比较研究

以进境种球中截获的带毒洋水仙和郁金香为试验材料,建立了ArMV的免疫捕获RT-PCR、巢式PCR和Real-timePCR方法,并比较了几种检测方法的灵敏度。DAS-ELISA的检测灵敏度较低,为1 mg洋水仙或10 mg郁金香带毒种球,而各种PCR方法的灵敏度可高于DAS-ELISA 100倍以上,其中Real-time PCR检测的灵敏度最高,可从20 ng洋水仙或2μg郁金香的带毒种球中检出ArMV。鉴于DAS-ELISA灵敏度较低,建议在用ELISA初筛时,如样品OD405值与阴性对照OD405值之比在2.0左右时需要再用分子方法加以确证,以防漏检。

进境荷兰郁金香种苗中南芥菜花叶病毒的鉴定

为了防止南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic virus,ArMV)传入我国,采用血清学、分子生物学、电镜观察及生物学接种等方法对从荷兰进口的郁金香种苗进行了ArMV检测。结果表明:ArMV血清学反应为强阳性;RT-PCR反应扩增出370bp的特异性目标条带;RT-PCR产物与已报道的3个ArMV部分外壳蛋白基因的核苷酸序列同源性为91.00%～93.24%,氨基酸序列同源性为99%～100%;免疫电镜观察到叶片病汁液中含有直径约30nm的球状病毒粒体;该病毒在黄花烟、白肋烟、矮牵牛和昆诺藜等鉴别寄主上引起坏死和褪绿等典型症状,经DAS-ELISA检测,这些接种寄主均呈ArMV血清学阳性反应。故将该病毒鉴定为南芥菜花叶病毒。

进境唐菖蒲种球南芥菜花叶病毒分子鉴定

Arabis mosaic virus(ArMV)had been found in the Gladiolus hybridus imported from the Netherlands by DAS-ELISA.Two pairs of primers were designed according to the conserved region of the coat protein(CP) gene sequence of Arabis mosaic virus(ArMV),and two amplified bands with expected sizes of 750 bp and 250 bp were obtained by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The sensitivity of nested PCR was higher than that of single RT-PCR.Analysis of the partial sequenced CP gene showed that the isolate was closed to ArMV with similarity of 99.0%-100%.All the results demonstrated that the isolated virus was ArMV.

福建口岸从英国进境水仙种球上截获南芥菜花叶病毒和水仙潜隐病毒

2011年11月，福建出入境检验检疫局技术中心对一批英国进境水仙种球进行检疫，采用ELISA初筛，RT—PCR及序列测定确认的方法，从中同时检出南芥菜花叶病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）和水仙潜隐病毒（Narcissus latent virus，NLV）。这2种植物病毒均为福建局首次检出。