单双次气管内滴注博来霉素诱导肺纤维化大鼠模型的比较

目的采用单次及两次气管内滴注博来霉素(bleomycin,BLM)构建肺纤维化大鼠模型,比较2种造模方式的成模率及稳定性。方法150只SPF级SD大鼠随机分成空白对照组(Control组)、单次气管内滴注博来霉素组(BLM-S组)、两次气管内滴注博来霉素组(BLM-M组)。BLM-S组第1天采用无创气管内滴注BLM(3 mg/kg,单次)诱导;BLM-M组第1、14天分别气管内滴注BLM(3、2 mg/kg)诱导,Control组采用无创气管内滴注0.9%氯化钠注射液(1 mL/kg);于造模后第28、42、56、84天分批取材。检测大鼠深吸气量(inspiratory capacity,IC)、肺活量(vital capacity,VC)、静态肺顺应性(static compliance of lung,Cchord)及动态肺顺应性(dynamic lung complication,Cdyn);观察大鼠肺组织病理变化,并对肺泡炎及纤维化程度进行评分;采用免疫组化检测大鼠肺组织Ⅲ型胶原蛋白(collagen-Ⅲ,COL-Ⅲ)表达。结果(1)一般状态及生存情况:Control组、BLM-S组和BLM-M组生存率分别为:100%、80%、66%。第14~42天,BLM-S组与BLM-M组大鼠体重显著低于Control组(P<0.05,P<0.01)。第28~42天,BLM-M组体重显著低于Control组、BLM-S组(P<0.05,P<0.01)。(2)肺功能:与Control组比较,第28天BLM-S组肺功能IC、VC、Cchord、Cdyn均显著下降(P<0.05,P<0.01),BLM-M组IC、VC、Cchord显著下降(P<0.05,P<0.01);第42天BLM-S组大鼠IC、VC、Cchord显著下降(P<0.05,P<0.01);第42~84天BLM-M组大鼠IC、VC、Cchord明显下降(P<0.05,P<0.01)。(3)肺病理:第28~84天,BLM-S组大鼠出现炎性浸润及纤维条索后逐渐减少(P<0.05,P<0.01);BLM-M组大鼠出现纤维化及肺泡炎后较为稳定(P<0.05,P<0.01)。(4)胶原沉积:各时间点BLM-S组、BLM-M组大鼠肺组织内COL-Ⅲ表达显著高于Control组(P<0.05,P<0.01);第42~84天BLM-S组COL-Ⅲ含量显著低于28 d(P<0.05)。结论2种造模方式均可成功建立肺纤维化模型,其中单次法操作简便,大鼠死亡率更低,28 d时纤维化程度明显,但在42 d之后会逐渐恢复;两次法造模成功率更高,模型稳定性更好,至84 d仍有超半数大鼠存在明显纤维化。

尼可地尔抑制博来霉素诱导肺纤维化机制的研究

目的探讨尼可地尔抑制博来霉素诱导肺纤维化的机制。方法实验选用健康清洁级SD雄性大鼠60只,按照随机数字表法分为正常对照组、博来霉素组、醋酸泼尼松组和尼可地尔组,每组15只。于第1、3、7、14、21天,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血浆转化生长因子-β1(TGF-β1)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,采用黄嘌呤氧化酶法、硫代巴比妥酸法分别检测大鼠肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平;于第21天,采用Western Blotting法检测大鼠肺组织匀浆中TGF-β1、TNF-α、SOD及MDA蛋白表达,应用苏木精-伊红染色法(HE)观察第1、3、7、14、21天大鼠肺组织病理变化。结果博来霉素组、醋酸泼尼松组、尼可地尔组各时点血浆TNF-β1及肺组织匀浆MDA水平均明显高于对照组,博来霉素组各时点肺组织匀浆SOD水平均低于对照组,醋酸泼尼松组、尼可地尔组各时点肺组织匀浆SOD水平均高于对照组(P<0.05);第7、14、21天,博来霉素组、醋酸泼尼松组、尼可地尔组血浆TNF-α水平均高于对照组,博来霉素组第1、3天血浆TNF-α水平均高于对照组(P<0.05);醋酸泼尼松组、尼可地尔组各时点血浆TGF-β1、TNF-α及肺组织匀浆MDA水平均明显低于博来霉素组,SOD水平均高于博来霉素组,差异有统计学意义(P<0.05);其他各组各时间点血浆TGF-β1、TNF-α及肺组织匀浆SOD、MDA水平两两比较差异均无统计学意义。博来霉素组、尼可地尔组肺组织匀浆中TGF-β1、TNF-α及MDA蛋白表达均高于对照组,醋酸泼尼松组肺组织匀浆中TNF-α及MDA蛋白表达均高于对照组,博来霉素组肺组织匀浆中SOD蛋白表达低于对照组,醋酸泼尼松组、尼可地尔组肺组织匀浆中SOD蛋白表达均高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);醋酸泼尼松组肺组织匀浆中TGF-β1蛋白表达低于博来霉素组,醋酸泼尼松组和尼可地尔组肺组织匀浆中TNF-α及MDA蛋白表达均低于博来霉素组,SOD蛋白表达均高于博来霉素组,差异有统计学意义(P<0.05);尼可地尔组与博来霉素组肺组织匀浆中TGF-β1蛋白表达比较差异无统计学意义;尼可地尔组肺组织匀浆中TNF-α、MDA蛋白表达均高于醋酸泼尼松组,SOD蛋白表达低于醋酸泼尼松组,差异有统计学意义(P<0.05);醋酸泼尼松组与尼可地尔组肺组织匀浆中TGF-β1蛋白表达比较差异无统计学意义。肺组织病理切片HE染色结果显示,对照组肺泡壁完整,肺泡腔大小均匀且无渗出;与对照组相比,博来霉素组(1~7 d)大鼠肺泡壁增厚,可见大量炎症细胞渗出,肺泡间隔增宽,14 d后可见少量成纤维细胞增生,肺组织结构紊乱,21 d后肺组织弥漫性肺纤维化;与博来霉素组相比,尼可地尔组和醋酸泼尼松组病理学改变显著改善,炎症反应及纤维化程度随着时间延长明显缓解,而尼可地尔组与醋酸泼尼松组病理学改变差异较小。结论尼可地尔通过调控TGF-β1、TNF-α、SOD及MDA蛋白表达抑制博来霉素诱导的肺纤维化。

石蒜碱通过抑制内质网应激干预博来霉素诱导肺纤维化小鼠

目的研究石蒜碱通过抑制内质网应激干预博来霉素诱导肺纤维化小鼠。方法实验时间为2022年1月至2月,选取50只小鼠,雄性,体质量22~26 g,按随机数字表法分为五组:正常组、模型组、石蒜碱低剂量组、石蒜碱中剂量组、石蒜碱高剂量组,每组10只。通过口咽气管滴注法滴注博来霉素生理盐水溶液复制肺纤维化小鼠模型,连续灌胃给药28 d。苏木精-伊红染色(HE染色)、Masson三色染色检测小鼠肺组织病理变化,Western Blotting检测肺组织中免疫球蛋白重链结合蛋白(Bip)、内质网调节激酶(PERK)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、磷酸化真核细胞起始因子2α(p-eIF2α)蛋白表达水平。统计学方法采用单因素方差分析。结果模型组小鼠分组结构紊乱,肺泡壁增厚,肺泡内有严重的炎性细胞浸润,肺泡间质有很多胶原沉积;石蒜碱各剂量组肺组织的上述病理改善较模型组有改善,且石蒜碱中剂量组和石蒜碱高剂量组肺组织的病理改善最为明显;模型组Masson的胶原面积高于正常组[(34.42±5.13)mm^(2)比(5.15±1.16)mm^(2)],石蒜碱高剂量组胶原面积低于石蒜碱中剂量组[(15.70±4.09)mm^(2)比(19.83±3.14)mm^(2)],差异均有统计学意义(均P<0.05);模型组肺组织中Bip、PERK、α-SMA、p-eIF2α蛋白表达水平均高于正常组,石蒜碱中剂量组和石蒜碱高剂量组肺组织中Bip、PERK、α-SMA、p-eIF2α蛋白表达水平均低于模型组,石蒜碱高剂量组肺组织中Bip、PERK、α-SMA、p-eIF2α蛋白表达水平均低于石蒜碱中剂量组。结论石蒜碱可以干预博来霉素诱导肺纤维化小鼠,且其作用机制可能为抑制内质网应激。

IL-27在博来霉素诱导肺纤维化模型中的保护作用

目的探讨IL-27在博来霉素诱导肺纤维化模型中的作用.方法将80只C57BL/6小鼠随机分为正常组(A组)、BLM模型组(B组)、BLM+IL-27组(C组)、BLM+抗IL-27组(D组),每组各20只.观察A、B组小鼠肺组织IL-27、IL-27R m RNA表达.各组分别于7 d、28 d各处死小鼠5只,获取肺组织,病理学方法观察各组小鼠肺组织肺泡炎症和肺纤维化程度,测定肺组织羟脯氨酸含量,观察各组小鼠生存情况.结果 (1)IL-27、IL-27R m RNA在肺纤维化形成中明显升高(P<0.05);(2)病理结果提示:7 d D组肺泡炎和肺纤维化程度最重,C组最轻(P<0.05);28 d D组肺纤维化程度较B组加重,C组最轻(P<0.05);(3)羟脯氨酸含量变化:7 d,28 d D组肺组织羟脯氨酸含量最高,C组含量最少(P<0.05);(4)各组小鼠在28 d时A组无小鼠死亡,C组死亡率低于B组,D组死亡率高于B组(P<0.05).结论 IL-27抑制博来霉素诱导肺纤维化的形成,提高了小鼠的生存率.

肺纤方对博来霉素诱导肺纤维化大鼠wnt3a、β-catenin、WIF1和LRP表达的影响

目的观察肺纤方对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠wnt3a、β-catenin、WIF1、LRP表达的影响,探讨其抗肺纤维化的作用机制。方法采用气管插管滴注博来霉素制作肺纤维化大鼠模型。将120只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、泼尼松组和肺纤方高、中、低剂量组,造模次日给予相应药物灌胃。于造模后第14、28日分2批进行动物处理,Western blot检测wnt3a、β-catenin、WIF1的蛋白表达,RT-PCR检测LRP的mRNA表达。结果与假手术组比较,第14、28日模型组大鼠肺组织wnt3a、β-catenin、LRP表达均显著升高(P<0.05,P<0.01),第28日WIF1表达显著降低(P<0.05);与模型组比较,肺纤方中剂量组第14、28日大鼠肺组织wnt3a、β-catenin、LRP表达显著降低(P<0.05,P<0.01),WIF1表达显著升高(P<0.05,P<0.01)。结论肺纤方具有抗肺纤维化的作用,其机制可能与抑制模型大鼠wnt3a、β-catenin、LRP的过表达和增加WIF1的低表达有关。

血管紧张素转化酶抑制剂对博来霉素诱导肺纤维化大鼠肺功能改变的影响

目的探讨血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)对博来霉素诱导肺纤维化大鼠肺功能改变的影响。方法在博来霉素诱导肺纤维化大鼠模型的基础上,采用卡托普利对肺纤维化大鼠进行干预。检测大鼠肺泡炎、肺纤维化半定量评分,支气管肺泡灌洗液(BALF)中转化生长因子-β1(TGF-β1)、干扰素γ(INF-γ)、白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6水平,肺组织匀浆中过氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及肺组织羟脯氨酸(HYP)水平,BALF和血清中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP-1)水平,并在显微镜下观察大鼠肺组织形态学改变。结果卡托普利可显著减轻博来霉素诱导的肺纤维化大鼠的肺纤维化评分,升高BALF中TGF-β1水平,并降低INF-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6水平;肺组织匀浆SOD水平升高,MDA及HYP水平降低;血清及BALF中MMP-9、TIMP-1均呈降低趋势,镜下观察肺纤维化明显减轻。结论卡托普利对博来霉素诱导肺纤维化大鼠的肺功能下降有明显的抑制作用。

异甘草酸镁对博来霉素诱导肺纤维化大鼠治疗作用及其机制

目的探讨异甘草酸镁(MgIG)对博来霉素(BLM)诱导肺纤维化大鼠治疗作用及其机制。方法选择24只成年雄性SD大鼠,随机将其分为Control组、BLM组、BLM+MgIG组和BLM+甲泼尼龙琥珀酸钠(MTH)组4组各6只大鼠。BLM组、BLM+MgIG组和BLM+MTH组予BLM构建肺纤维化大鼠模型,Control组予0.9%氯化钠注射液。造模成功24 h后,Control组和BLM组予0.9%氯化钠注射液,BLM+MgIG组予MgIG注射液,BLM+MTH组予注射用MTH。连续给药28 d后处死大鼠,测定血清超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量;肺组织切片病理检查,采用Masson染色及肺纤维化程度评分评价大鼠肺组织纤维化程度,免疫组织化学检查肺组织转化生长因子-β1(TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)表达水平,蛋白质印迹法检测肺组织TGF-β1、TNF-α及IFN-γ蛋白水平。结果肺纤维化程度评分Control组低于其他3组,BLM组高于BLM+MgIG组和BLM+MTH组,BLM+MgIG组低于BLM+MTH组,差异有统计学意义(P<0.05)。Control组血清SOD高于其他3组,血清MDA低于其他3组,肺组织TGF-β1和TNF-α表达低于其他3组,肺组织IFN-γ表达高于其他3组;BLM组血清SOD低于BLM+MgIG组和BLM+MTH组,血清MDA高于BLM+MgIG组和BLM+MTH组,肺组织TGF-β1和TNF-α表达高于BLM+MgIG组和BLM+MTH组,肺组织IFN-γ表达低于BLM+MgIG组和BLM+MTH组;BLM+MgIG组血清SOD高于BLM+MTH组,血清MDA低于BLM+MTH组,肺组织TGF-β1和TNF-α表达低于BLM+MTH组,肺组织IFN-γ表达高于BLM+MTH组,差异有统计学意义(P<0.05)。大鼠肺组织TGF-β1和TNF-α蛋白Control组表达量较低,BLM组表达量升高,BLM+MgIG组和BLM+MTH组表达量低于BLM组;大鼠肺组织IFN-γ蛋白Control组表达量较高,BLM组表达量降低,BLM+MgIG组表达量较BLM组明显增加。结论MgIG能改善BLM诱导肺纤维化大鼠肺纤维化,机制可能与减轻氧化应激,抑制炎性因子表达,促进抗纤维化因子分泌有关。

丁苯酞对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的治疗作用

目的探讨丁苯酞对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的治疗作用。方法实验动物随机分为正常对照组、模型组、丁苯酞治疗组(14 d治疗组和28 d治疗组),制备博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型,正常对照组和模型组小鼠按体质量10 mL/kg灌胃玉米油,丁苯酞治疗组每天灌胃丁苯酞180 mg/kg,连续14 d和28 d,观察小鼠体质量的变化,并分别于末次给药24 h后小鼠取材,测定肺指数及湿干质量比、血清IL-1β和TNF-α水平、肺组织中MDA和SOD含量,进行肺组织病理学检查。结果各组动物体质量、肺指数及湿干质量比差异不明显,与模型组相比,丁苯酞治疗组给药14 d和28 d后其血清中IL-1β、TNF-α水平显著降低(P<0.01),肺组织中的MDA水平显著降低(P<0.01),SOD含量明显升高(P<0.01),肺组织病理学损伤明显减轻,肺纤维化程度评分分值显著降低(P<0.01);与丁苯酞治疗组给药14 d相比,给药28 d的血清中IL-1β水平显著降低(P<0.01),SOD含量明显升高(P<0.01)。结论丁苯酞能降低博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型炎症因子水平,提高抗氧化应激能力,对肺纤维化具有一定的治疗作用,且给药28d治疗效果好。

紫草素对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的作用及机制

目的探讨紫草素对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的作用及机制。方法选取8~10周龄SPF级小鼠,将20只设对照组,剩余小鼠予以博来霉素诱导肺纤维化,成功造模80只,分为治疗组(紫草素腹腔注射)、对照干预组(同等剂量生理盐水腹腔注射后给予紫草素腹腔注射)、治疗干预组(治疗组处理的基础上给予shAMPK慢病毒剂尾静脉注射)、模型组(不作任何处理)。对照组给予同等剂量生理盐水腹腔注射。通过检测肺中胶原蛋白的含量,HE染色,Masson染色评估肺纤维化程度。Western Blot检测NOX4、CollagenI、α-SMA蛋白水平。通过siRNA沉默AMPK基因探讨紫草素对博来霉素诱导肺纤维化的机制。结果模型组小鼠肺胶原尿蛋白含量及出现肺组织炎症细胞浸润、间质纤维化较对照组明显增加(P<0.05),而治疗组小鼠肺中的胶原尿蛋白含量及出现肺组织炎症细胞浸润、间质纤维化较模型组明显降低(P<0.05)。较对照组相比,模型组Nox4、p-smad3、α-SMA在肺组织中的光密度明显增加(P<0.05),而治疗组与模型组比较以上蛋白的表达明显被抑制(P<0.05)。Western Blot的结果显示NOX4及细胞外基质(Collagen I、α-SMA)在模型组小鼠肺组织中大量表达,但治疗组小鼠以上蛋白分子的表达被明显抑制(P<0.05),且在对照干预组中,紫草素不影响NOX4、CollagenI、α-SMA的表达改变。与对照组相比,模型组小鼠肺组织中NOX4、CollagenI、α-SMA的表达明显升高,p-AMPK表达降低(P<0.05),而治疗组小鼠肺组织NOX4、CollagenI、α-SMA的表达升高及p-AMPK的表达降低均得到了缓解,但治疗干预组中对NOX4、CollagenI、α-SMA的表达抑制被解除,同时抑制了紫草素对p-AMPK的表达增加(P<0.05)。结论紫草素通过AMPK来抑制NOX4的表达从而减轻博来霉素诱导小鼠肺纤维化。

博来霉素诱导肺纤维化小鼠中差异表达的lncRNA筛选及生物信息学分析

目的:探讨博来霉素(BLM)诱导的肺纤维化小鼠模型肺组织中差异表达的长链非编码RNA(lncRNA),并对其进行生物信息学分析。方法:将12只6~8周龄的C57BL/6小鼠随机分为对照组和实验组,每组6只,实验组小鼠气管内滴注BLM构建肺纤维化模型,取小鼠肺组织进行芯片微阵列分析,筛选出差异表达的lncRNA,对差异表达的lncRNA进行靶基因预测,并对靶基因进行GO(gene ontology)富集与KEGG(Kyoto Encyclope-dia of Genes and Genomes)信号通路分析。结果:与对照组相比,肺纤维化模型组小鼠肺组织识别出差异表达的lncRNA共1 384个,其中表达上调的lncRNA有645个,表达下调的lncRNA有739个,并通过对差异表达lncRNA的靶基因预测,对靶基因进行GO富集与KEGG信号通路分析提示差异表达的lncRNA可能通过钙信号通路、PI3KAKT信号通路、Ras信号通路、Wnt信号通路、JAK-STAT信号通路和TGF-β信号通路等对肺纤维化进行调控。结论:基于芯片微阵列分析技术,lncRNA在BLM诱导的肺纤维化模型小鼠与正常小鼠肺组织中的表达存在差异,并在调控肺纤维化过程中可能涉及多个信号通路。

扶正化瘀方调控TGF-β/Smad信号通路对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的影响

目的探讨扶正化瘀方对博来霉素诱导肺纤维化小鼠的作用。方法将小鼠随机分为模型组、扶正化瘀方组(5.6 g/kg)和尼达尼布组(60 mg/kg),每组15只,采用无创气管插管经气道滴注博来霉素(2.5 mg/kg)复制小鼠肺纤维化模型;另取10只正常小鼠予气道滴注等体积生理盐水,作为正常组。造模7 d后,各组灌胃相应剂量药物,连续给药14 d。末次给药24 h后,使用肺功能仪测定小鼠气道狭窄指数、呼吸频率和潮气量,试剂盒检测血清羟脯氨酸(Hyp)水平,苏木素-伊红和Masson染色分别观察肺组织炎症和胶原沉积水平,ELISA法检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6水平,免疫组化观察肺组织α-SMA表达,蛋白印迹法检测小鼠肺组织α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达。结果与正常组比较,模型组小鼠呼吸急促,体质量降低(P<0.01),Penh值增加(P<0.01),f、TV减少(P<0.01),肺组织大量炎性细胞浸润和大量胶原纤维沉积并有纤维节结生成,血清Hyp、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01),肺组织α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,扶正化瘀方组和尼达尼布组小鼠呼吸平稳,Penh值降低(P<0.01),f、TV增加(P<0.01),肺组织炎性细胞浸润和胶原纤维沉积减少(P<0.01),血清Hyp、IL-6、TNF-α水平降低(P<0.01),肺组织α-SMA、TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达降低(P<0.01)。结论扶正化瘀方可抑制博来霉素诱导的小鼠实验性肺纤维化,其作用机制可能与调控TGF-β/Smad信号通路有关。

基于凝血级联途径研究血栓通注射液对博来霉素诱导肺纤维化大鼠的作用机制

基于凝血级联途径探讨血栓通注射液(Xueshuantong Injection,XST)对博来霉素(bleomycin,BLM)所致肺纤维化大鼠的作用机制。将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、吡非尼酮组(pirfenidone,PFD,50 mg·kg^(-1))组和27、54、81 mg·kg^(-1)XST组,采用气管内注入博来霉素(5 mg·kg^(-1))建立肺纤维化大鼠模型。24 h后,给药组分别给予相应的药物,假手术组、模型组给予等体积的生理盐水。第28天取材,观察大鼠肺部影像学与胶原纤维变化,并采用免疫荧光法检测大鼠肺组织α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、Ⅰ型胶原(collagenⅠ,Col-Ⅰ)、波形蛋白(vimentin,Vim)与E-钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)的表达,Western blot法检测肺组织α-SMA、Col-Ⅰ、Vim和E-cad的蛋白表达水平,采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠肺组织中凝血酶原片段(prothrombin fragment 1+2,F1+2)、凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)、可溶性纤维蛋白单体复合物(soluble fibrin monomer complex,SFMC)和大鼠血纤蛋白原降解产物(fibrinogen degradation product,FDP)含量,最后通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、Western blot与免疫荧光法测定肺组织中蛋白酶激活受体-1(protease-activated receptors-1,PAR-1)mRNA水平与蛋白水平。与模型组相比,给予XST后肺部扫描也显示出斑片状、不均匀的阴影,但这些阴影的密度低于模型组;同时大鼠肺部Ⅰ型胶原纤维显著减少;并且XST抑制上皮-间充质转化并下调α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表达。在凝血系统方面,给予81 mg·kg^(-1)XST可显著降低SFMC与FDP的含量;同时81 mg·kg^(-1)XST可显著下调PAR-1 mRNA水平与蛋白水平。XST具有抗大鼠肺纤维化的作用,其机制可能与下调PAR-1从而改善凝血途径的异常有关。

不同剂量博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型比较

目的 比较不同剂量博来霉素(bleomycin, BLM)气管内滴注诱导的大鼠肺纤维化(pulmonary disease, PF)模型的成功率及稳定性。方法 150只SD大鼠随机分为空白组、BLM低剂量组(BL-L组,3 mg/kg)和BLM高剂量组(BL-H组,5 mg/kg),造模后观察大鼠一般状态、死亡情况、体重变化,第28、42、56、84天检测大鼠深吸气量(inspiratory capacity, IC)、肺活量(vital capacity, VC)、肺准静态顺应性(chord compliance, Cchord)和肺动态顺应性(dynamic compliance, Cdyn),记录肺系数,HE、MASSON染色观察肺组织病理变化,检测肺组织羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量,免疫组化检测肺组织胶原蛋白III(collagen type III, COL III)表达。结果 BL-L组与BL-H组的死亡率分别为20%和28%。BL-L组体重在第0~56天低于空白组(P<0.01),第56天以后体重恢复。第0~56天BL-H组体重显著低于空白组和BL-L组(P<0.01)。与空白组比较,第28天,BL-L组肺功能IC、VC、Cchord、Cdyn显著降低(P<0.01,P<0.05),BL-H组IC和Cdyn显著下降(P<0.05),第42天,BL-L组IC、VC、Cchord显著下降(P<0.01,P<0.05),BL-H组IC、VC、Cchord、Cdyn显著下降(P<0.01,P<0.05),且IC、VC、Cchord与BL-L组相比显著降低(P<0.01),第56天,BL-H组Cchord显著低于空白组和BL-L组(P<0.01)。第28天,BL-L组和BL-H组肺系数显著高于空白组(P<0.01),第42~56天,BL-H组肺系数显著高于BL-L组和空白组(P<0.01)。BL-L组在第28~56天可观察到炎性浸润、纤维化条索和COL III表达,第84天纤维化病变几乎消失,BL-H组在28~84天均可观察到显著纤维化病变,COL III表达程度显著高于空白组(P<0.01)。第28~42天,BL-L组HYP含量显著高于空白组(P<0.05,P<0.01),后逐渐下降,第28~84天,BL-H组HYP含量显著高于空白组(P<0.01)。结论 3 mg/kg与5 mg/kg的BLM均可成功制备PF大鼠模型,BL-L组在第28天形成肺纤维化,持续至第42天;BL-H组在第28天形成更严重的肺纤维化,持续至第56天,第84天仍有半数存在中重度纤维化。

一种改良的博来霉素诱导的肺纤维化模型造模方法

目的建立博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型,比较经气管滴注和经气管吸入两种不同给药方式的成模差异。方法选择6~8周C57BL/6雄性小鼠46只,取6只小鼠随机分为经气管滴注组和经气管吸入组,每组3只。小鼠麻醉后分别经气管滴注和吸入亚甲蓝,观察小鼠双肺和胃内亚甲蓝的分布。取另40只小鼠随机分为经气管滴注+生理盐水组、经气管吸入+生理盐水组、经气管滴注+博来霉素组、经气管吸入+博来霉素组。观察各组小鼠造模后的精神状态、体质量变化和生存状况,并在第21日取肺组织用于组织学、羟脯氨酸和TGF-β、α-SMA和COL1A1等蛋白水平Western blotting检测。结果经气管滴注组,亚甲蓝不均匀且局限地分布于双肺,伴不同程度胃内残留。经气管吸入组,亚甲蓝较均匀且弥散地分布于双肺,无明显胃内残留。与两对照组相比,两模型组小鼠精神状态欠佳,体质量下降明显,死亡率升高;小鼠肺组织肺泡结构破坏严重,伴大量胶原沉积,羟脯氨酸含量显著升高(P<0.05),Western blotting显示肺组织TGF-β、α-SMA和COL1A1等蛋白的表达显著增多(P<0.05)。结论经气管吸入+博来霉素组小鼠纤维化病灶分布更加均匀,各项指标相对稳定,是建立肺纤维化模型理想的方法。

白术内酯Ⅲ调节TGF-β/Smad信号通路对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的保护作用

目的 探讨白术内酯Ⅲ调节转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路对博来霉素诱导小鼠肺纤维化的保护作用。方法 气管内注射博来霉素构建肺纤维化小鼠模型,随机分为模型组、白术内酯Ⅲ低剂量(10mg/kg)组、白术内酯Ⅲ高剂量(20mg/kg)组、白术内酯Ⅲ高剂量(20mg/kg)+SRI-011381(TGF-β激活剂,10mg/kg)组,每组12只,另取12只小鼠气管内注射等剂量生理盐水,设为对照组,分组处理后检测动脉血气指标氧分压(PaO_(2))和二氧化碳分压(PaCO_(2))并计算氧合指数(OI);HE染色检测各组小鼠肺组织病理形态;天狼星红染色检测各组小鼠肺组织纤维化;酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组小鼠肺组织羟脯氨酸(HYP)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TGF-β1水平及血清IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平;免疫印迹法检测各组小鼠肺组织胶原生成及TGF-β/Smad通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组小鼠肺组织发生肺泡间隔明显增厚及炎性细胞浸润等病理损伤,肺组织CVF及HYP水平、血清及肺组织IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平、CollagenⅠ及CollagenⅢ、TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3显著升高(P<0.05)。与模型组比较,白术内酯Ⅲ低剂量组、白术内酯Ⅲ高剂量组小鼠肺组织病理损伤均减轻,肺组织CVF及HYP水平、血清及肺组织IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平、CollagenⅠ及CollagenⅢ、TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3均降低(P<0.05);白术内酯Ⅲ高剂量组小鼠肺组织病理损伤相比白术内酯Ⅲ低剂量组进一步减轻,肺组织CVF及HYP水平、血清及肺组织IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平、CollagenⅠ及CollagenⅢ、TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3进一步降低(P<0.05)。与白术内酯Ⅲ高剂量组比较,白术内酯Ⅲ高剂量+SRI-011381组小鼠肺组织病理损伤加重,肺组织CVF及HYP水平、血清及肺组织IL-1β、TNF-α、TGF-β1水平、CollagenⅠ及CollagenⅢ、TGF-β1蛋白表达、p-Smad3/Smad3升高(P<0.05)。结论 白术内酯Ⅲ可通过抑制TGF-β/Smad信号激活而减轻博来霉素诱导的炎症,进而降低胶原蛋白表达,减轻肺纤维化。

雷公藤甲素通过抑制细胞铁死亡减轻博来霉素诱发的小鼠肺纤维化

目的:探讨雷公藤甲素(TPL)对博来霉素(BLM)诱导肺纤维化小鼠的改善效果,揭示铁死亡参与TPL改善肺纤维化的潜在机制。方法:选择SPF级小鼠,随机分为3组:对照组、模型组(BLM处理组)和实验组(BLM+TPL处理组),每组10只。Day 0,模型组和实验组小鼠气管灌注BLM水溶液(50μL,5 mg/kg),对照组小鼠接受等体积的生理盐水。Day 1起,实验组小鼠开始灌胃TPL悬液(200μL,0.25 mg/kg),每3 d一次,共7次,对照组和模型组分别接受等体积生理盐水。Masson染色检测肺组织纤维化,TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡;体外CCK8法检测细胞活力,流式细胞术及活死染色检测细胞凋亡,免疫荧光法检测细胞脂质过氧化,Western blot检测肺组织及细胞中目的蛋白表达。结果:TPL处理通过下调肺组织中Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达(P<0.05),显著降低BLM诱导小鼠肺部纤维化程度(P<0.01);同时,TPL处理可显著上调肺组织中谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)和铁死亡抑制蛋白1(FSP1)表达(P<0.05),下调转铁蛋白受体1(TfR1)表达(P<0.05),从而抑制BLM诱导的肺部细胞铁死亡和凋亡(P<0.01)。体外研究结果表明,TPL处理可显著抑制肺上皮细胞凋亡(P<0.01),进一步检测发现TPL处理可显著降低BLM诱导的肺泡上皮细胞内脂质过氧化(P<0.01),显著上调细胞内GPX4和FSP1蛋白表达(P<0.01),下调TfR1蛋白表达(P<0.05),通过抑制细胞铁死亡来显著降低BLM诱导的肺上皮细胞凋亡率。结论:TPL可在体内外通过抑制BLM诱导的细胞铁死亡,改善肺部细胞活力,降低细胞凋亡率,从而减轻肺小鼠纤维化程度。本研究为临床使用TPL治疗肺间质病变提供理论依据。

熊去氧胆酸通过调控TGF-β1/Smads信号通路对博来霉素诱导大鼠肺纤维化的影响

目的基于转化生长因子-β1(Transforming growth factor beta1,TGF-β1)/Smads信号通路探讨熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic Acid,UDCA)调控通过博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的作用机制。方法选取100只成年健康雄性Wistar大鼠作为研究对象,采用随机数表法进行分组,分为空白组、模型组、低剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组,每组各20只。除空白组大鼠外,其余各组均给予大鼠单次气管内滴注博来霉素来建立实验性的肺纤维化动物模型。于造模当天开始给予低剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠熊去氧胆酸(剂量分别为50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)、200 mg/(kg·d))1次/d灌胃。实验第1、7、14、21天所有各组分别抽取4只大鼠,采用酶联免疫吸附剂测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)检测大鼠血清中TGF-β1的表达水平。第21天采用苏木素-伊红染色(HE染色)法观察大鼠肺组织病理变化,采用Masson染色观察胶原沉积情况,采用Western Blotting方法观察各组大鼠肺组织中TGF-β1、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、α-SMA蛋白表达的情况。结果第7天,与模型组比较,中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠血清TGF-β1水平明显降低(P<0.01);与低剂量熊去氧胆酸+博来霉素组比较,中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠血清TGF-β1水平明显降低(P<0.01,P<0.05)。第14、21天,与模型组比较,低剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠血清TGF-β1水平明显降低(P<0.01)。第14天,与低剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组比较,高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠血清TGF-β1水平明显降低(P<0.05)。第21天,与低剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组比较,高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠血清TGF-β1水平明显降低(P<0.01);与模型组比较,低剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠肺组织中TGF-β1蛋白表达明显降低,p-Smad2/Smad2下降(P<0.01);与模型组比较,中剂量熊去氧胆酸+博来霉素组、高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠肺组织中α-SMA蛋白表达明显降低(P<0.01);与模型组比较,高剂量熊去氧胆酸+博来霉素组大鼠肺组织中p-Smad3/Smad3比值下降(P<0.05)。结论熊去氧胆酸能够减轻肺纤维化模型大鼠肺组织病理改变和减少胶原沉积,其作用机制可能与调控TGF-β1/Smads信号通路有关。

颗粒蛋白前体在博来霉素致肺纤维化小鼠中的表达

目的:探讨颗粒蛋白前体(PGRN)在博来霉素致肺纤维化小鼠肺组织中的表达。方法:选取C57BL/6小鼠36只,随机分为3组,博来霉素模型组向气管内灌注博来霉素(5 mg/kg)后第14、28天分批处死小鼠,生理盐水对照组注入等量的生理盐水。肺组织采用HE染色和Masson染色观察小鼠肺组织炎症和纤维化情况,以免疫组化法检测PGRN在肺组织中的分布和表达,蛋白印迹法检测PGRN在小鼠肺组织中的蛋白表达水平。结果:光镜下观察发现,生理盐水对照组小鼠肺组织结构完整,少量炎症细胞浸润;博来霉素组小鼠肺组织结构破坏,炎症细胞浸润,呈弥漫性肺纤维化改变。免疫组化检测可见博来霉素组小鼠PGRN在肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞中的阳性率明显高于生理盐水对照组,肺组织中PGRN蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。结论:PGRN可能参与了博来霉素致小鼠肺纤维化的过程。

NDNF低表达对博来霉素致肺纤维化小鼠炎症反应、氧化应激和EMT的影响

目的探讨神经元源性神经营养因子(NDNF)低表达对博来霉素致肺纤维化小鼠肺炎症反应、氧化应激和上皮-间质转分化(EMT)的影响。方法采取气管注入博来霉素(5 mg/kg)构建肺纤维化小鼠模型(肺纤维化组)、尾静脉注射siRNA-NDNF腺病毒载体建立NDNF低表达肺纤维化组(siRNA-NDNF组)、同时设置空载体组及健康组;于造模成功后2周时,采用HE及Masson染色观察小鼠肺组织病理变化(肺泡炎症评分)和肺纤维程度(肺纤维化占比),ELISA法检测肺组织炎性因子[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素(IL)-4和IL-6]、氧化应激因子[丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和超氧化物歧化酶(SOD)]及羟脯氨酸(HYP)水平,Western blot检测各组小鼠肺组织EMT相关蛋白[E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Snail1和Collagen I]表达。结果肺纤维化组小鼠肺泡结构破坏程度严重、肺泡残缺严重、明显炎症浸润、大面积胶原纤维沉积,肺系数、肺纤维化占比、肺泡炎症评分和肺组织HYP水平均高于健康组(P<0.05);siRNA-NDNF组小鼠肺泡结构损伤、炎性浸润和胶原纤维蓝色区域较空载体组减少,肺系数、肺纤维化占比、肺泡炎症评分和肺组织HYP水平低于空载体组(P<0.05);肺纤维化组小鼠肺组织TNF-α、TGF-β1、IL-6、IL-4、MDA、ROS水平和α-SMA、Snail1、Collagen I蛋白表达均高于健康组(P<0.05),肺组织SOD水平和E-cadherin蛋白表达低于健康组(P<0.05);siRNA-NDNF组小鼠肺组织TNF-α、TGF-β1、IL-6、IL-4、MDA、ROS水平和α-SMA、Snail1、Collagen I蛋白表达均低于空载体组(P<0.05),肺组织SOD水平和E-cadherin蛋白表达高于空载体组(P<0.05)。结论低表达NDNF可以改善小鼠肺纤维化损伤,其机制可能与减轻炎症及氧化应激反应、调节肺EMT相关蛋白表达有关。

萝卜硫素激活Nrf2通路抑制内质网应激改善博来霉素诱导的肺纤维化

肺纤维化是一种常见的间质性肺疾病,临床症状表现为干咳和呼吸困难,伴有限制性通气功能异常和弥散功能降低,其发病率逐年上升,且预后不佳。其病理早期表现为肺泡细胞损伤和凋亡,最终出现细胞外成纤维细胞增殖及胶原沉积。研究表明,失控的氧化应激、氧化/抗氧化平衡失调是诱导肺纤维化发生的分子学基础[1];内质网应激(ERS)通过促进肺泡上皮细胞凋亡、改变上皮细胞表型、促进成纤维细胞分化等方式也参与纤维化的发生及发展[2]。