恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面抗原2(MSA-2)基因在卡介苗BCG中的表达

目的 :裂殖子表面抗原 2基因 (Merozoitesurfaceantigen 2 ,MSA2 )是恶性疟原虫的一种保护性抗原 ,为研究其重组BCG疫苗的保护作用 ,首先探讨携带有恶性疟原虫FCC 1 HN株MSA2基因的重组分枝杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pBCG MSA2在卡介苗 (BacillusCalmetteGuerin ,BCG)中的表达情况。方法 :采用电穿孔转化法将重组质粒pBCG MSA2导入BCG中 ,通过卡那霉素抗性筛选并经PCR鉴定的重组BCG培养于Middlebrook 7H9Broth (M7H9)培养基 ,并添加 10 %M7H9EnrichmentADC和 0 0 5 %Tween80 ,4周后于 4 5℃进行诱导表达 ,表达产物进行十二烷基磺酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis,SDS PAGE)及免疫印迹 (Western blot)分析。结果 :SDS PAGE及Western blot分析结果均显示在约 31kDa的位置上可见明显的蛋白条带 ,并与MSA2基因编码序列推断的分子量相符。结论 :恶性疟原虫裂殖子表面抗原 2可在BCG中表达 。

敲低双特异性磷酸酶5(DUSP5)通过阻断NF-κB信号抑制卡介苗诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应

目的探讨双特异性磷酸酶5(DUSP5)对卡介苗(BCG)介导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎性反应的调控作用。方法Western blot法检测BCG感染RAW264.7巨噬细胞0.5、1、2、4、6、8、12、24 h,DUSP5表达变化;采用小干扰RNA(siRNA)技术下调RAW264.7巨噬细胞DUSP5水平,并设置siRNA阴性对照(si-NC)组、DUSP5敲低(si-DUSP5)组、si-NC联合BCG感染组、si-DUSP5联合BCG感染组。实时定量PCR检测细胞白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-10的mRNA表达,ELISA检测细胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10含量;Western blot法检测细胞核因子κB(NF-κB)与磷酸化的NF-κB(p-NF-κB)表达变化。结果BCG感染上调RAW264.7巨噬细胞核DUSP5蛋白表达,并在BCG刺激4 h后,DUSP5表达量达到高峰;与si-NC联合BCG感染组相比,敲低DUSP5抑制细胞促炎因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达与分泌,而抑炎因子IL-10表达不受DUSP5的影响;且敲低DUSP5抑制细胞NF-κB磷酸化。结论敲低DUSP5通过阻断NF-κB信号抑制BCG介导的巨噬细胞炎性反应。

卡介苗(BCG)感染对U937细胞系蛋白质乙酰化水平的影响

研究卡介苗(BCG)感染对U937细胞系蛋白质乙酰化水平的影响。构建U937巨噬细胞模型,感染BCG后提取细胞总蛋白,western blot方法检测细胞总蛋白乙酰化水平的改变。结果表明,在分化成熟的U937细胞系中,BCG感染能够上调蛋白质乙酰化水平,引起表观遗传学的改变。

敲低Wnt7a抑制卡介苗诱导的小鼠肺泡上皮细胞自噬

目的探究无翅基因7a(Wnt7a)对牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)感染的肺泡上皮细胞自噬水平的调控作用。方法使用干扰Wnt7a慢病毒及BCG单独作用或共处理TC-1小鼠肺泡上皮细胞,设置小干涉RNA对照(si-NC)组、si-NC联合BCG组、Wnt7a小干涉RNA(si-Wnt7a)组和si-Wnt7a联合BCG组。Western blot法检测Wnt7a、微管相关蛋白1轻链3(LC3)、P62及自噬相关基因5(ATG5)蛋白表达水平,利用免疫荧光细胞化学染色检测LC3的分布以确定细胞自噬情况。结果与si-NC组相比,BCG感染的TC-1细胞Wnt7a、LC3和ATG5蛋白表达均升高、LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著增加;与BCG组感染的TC-1细胞相比,si-Wnt7a联合BCG组Wnt7a、LC3、P62及ATG5蛋白表达均显著降低,LC3绿色荧光斑点亮度与分布显著降低。结论敲低Wnt7a抑制BCG诱导的肺泡上皮细胞自噬。

膀胱灌注卡介苗治疗中高危非肌层浸润性膀胱癌疗效预测模型的建立

目的探讨膀胱灌注卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)对于中高危非肌层浸润性膀胱癌(nonmuscle invasive bladder cancer,NMIBC)的疗效,结合术前血液学指标建立疗效预测模型筛选获益人群。方法 回顾性分析2014年1月至2019年1月收治于复旦大学附属中山医院泌尿外科258例中高危NMIBC患者。所有患者均采用尿道膀胱肿瘤切除术后膀胱灌注卡介苗治疗,记录患者术前血液学指标及临床病理信息。在训练集(n=180)中采用LASSO回归和Cox多因素回归模型筛选预后因子,同时建立疗效预测模型,利用C-index验证模型预测效能,并在验证集(n=78)中进行确认。结果 258例患者均获得有效随访,中位随访时间为53.0个月(12.0~98.2个月),总体复发率为31.0%(80/258),1年复发率为15.1%(39/258),3年复发率为25.6%(66/258),通过LASSO回归方法筛选出中性粒细胞和C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)作为预后因子,纳入多因素Cox分析,显示灌注前行二次经尿道膀胱肿瘤切除术(P=0.001),高龄(>70岁)(P=0.008)、CRP(P=0.002)和中性粒细胞(P=0.044)是中高危NMIBC患者行膀胱灌注卡介苗疗效的独立预测因子。疗效预测模型在训练集中的C-index为0.744,在验证集中的C-index为0.847。结论 膀胱灌注卡介苗治疗对中高危NMIBC安全有效,本研究所建立疗效预测模型(包含中性粒细胞、CRP、高龄和二次经尿道膀胱肿瘤切除术)预测中高危NMIBC患者膀胱灌注卡介苗疗效的准确性较高。

弓形虫GRA4和SAG2基因重组BCG疫苗免疫保护性的比较研究

目的比较弓形虫致密颗粒蛋白4(GRA4)基因和表面抗原2(SAG2)基因的重组卡介苗(BCG)对小鼠的免疫保护效果。方法108只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分成6组:PBS组、BCG空白菌组、BCG-空白载体组、BCG-SAG2组、BCG-GRA4组和BCG-SAG2+GRA4组,每组18只。每鼠分别注射对应液体/疫苗100μl,共2次,间隔2周。接种前尾静脉采血,接种后4、6、8周每组分别剖杀3只,取脾和眼眶血检测细胞因子、IgG与IgM抗体,T淋巴细胞亚群计数,淋巴细胞转化率等。末次免疫后3周,每组剩余小鼠分别腹腔接种RH株弓形虫速殖子50个进行攻击感染,观察各组小鼠存活时间。结果弓形虫SAG2和GRA4重组BCG疫苗均能诱导小鼠产生免疫应答。第4周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的CD3+CD4+/CD3+CD8+的比值最高,为14.06%±1.17%。第6周时,BCG-GRA4+SAG2免疫组小鼠的IgG抗体水平最高,为0.18±0.02。第8周时,BCG-SAG2免疫组小鼠的IgM抗体水平最高,为0.82±0.05;弓形虫速殖子攻击后,BCG-SAG2组平均存活8.61d,PBS对照组平均存活7.33d,3个免疫组小鼠比其他3组的平均存活时间长1d。结论弓形虫重组BCG疫苗具有一定的免疫保护性。

cAMP在LPS及BCG +LPS诱导的免疫性肝损伤中的作用比较(英文)

目的 比较LPS、BCG +LPS诱导的免疫性肝损伤模型的特点及肝中cAMP的变化 ,以建立合适的动物模型 ,并为药物作用及肝损伤机制探讨提供参考。方法 昆明种小鼠 ,分为 5组 :①对照组 ;②BCG组 (ip 1mg·kg- 1 BCG ,7d后处理动物 ) ;③LPS 0 2mg ;④LPS 0 4mg组 (分别ip 0 2 ,0 4mg·kg- 1 ,6h后处理动物 ) ;⑤BCG +LPS组 (ip 1mg·kg- 1 BCG 7d后ip 0 2mg·kg- 1 LPS 6h后处理动物 )。取血清 ,测定ALT、GST活性 ;HE染色 ,光镜观察组织损伤情况 ;制备肝匀浆 ,放射免疫法测定cAMP含量。结果 组织学检查表明 ,给予BCG或LPS均能引起中性粒细胞浸润。单独给予BCG或 0 2mg·kg- 1 LPS未见明显的肝组织损害 ,但经BCG预处理后 ,0 2mg·kg- 1 LPS可使血清ALT、GST水平显著增高。单独给予 0 4mg·kg- 1 LPS也能引起明显的肝组织损伤。经BCG预处理后的小鼠肝组织内cAMP含量明显下降 ,而单独LPS刺激 ,则使肝内cAMP含量呈剂量依赖性增高。结论 LPS、BCG +LPS均能引起典型的免疫性肝损伤 ,经BCG预处理 ,能增强内毒素刺激诱导的肝脏毒性。不同的免疫性肝损伤模型所致肝内cAMP含量的变化不同 。

栀子、首乌对小鼠卡介苗炎症诱导抑郁模型的抗抑郁作用的实验研究

目的腹腔注射卡介苗(BCG),建立炎症相关抑郁模型,明确栀子、首乌对炎症诱导抑郁模型的抗抑郁作用和机制。方法小鼠腹腔注射卡介苗200 mg.kg-1,吗氯贝胺组和栀子首乌组同时分别给予吗氯贝胺75 mg.kg-1和栀子首乌500 mg.kg-1水溶液灌胃,观察药物对动物体重、自主活动和强迫游泳实验中不动时间的影响。同时,使用ELISA法检测脑组织吲哚胺-23,-过氧化酶(IDO)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR1)含量。结果与模型组比较,栀子首乌药不能对抗BCG引起的小鼠体重下降(P>0.05),对小鼠的自主活动没有明显影响(P>0.05),但能明显缩短BCG模型小鼠强迫游泳不动时间(P<0.05),同时降低了脑组织中IDO和NMDAR1含量(P<0.05或P<0.01)。结论 BCG腹腔注射能引起动物抑郁样行为,栀子、首乌选择性增加小鼠不动时间,显示出一定的抗抑郁作用,其作用机制与抑制IDO活性减少五羟色胺(5-HT)代谢,下调NMDAR1减轻神经元毒性损伤有关。

常规培养与缺氧条件下BCG菌体内外sRNA的表达检测

近期发现细菌的sRNA在菌体内和菌体外均具有一定的生物学功能。为研究结核分枝杆菌菌体内外sRNA的表达情况,通过分析卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin Vaccine,BCG)菌体和外泌体RNA测序结果,采用RT-qPCR法检测常规培养与缺氧条件下BCG菌体内外sRNA相对表达量,分析菌体内外sRNA谱的差异。结果显示,常规培养时,菌体内丰度较高的sRNA为MTS2823、MTS1338与ASdes,菌体外丰度较高的为Mcr3、MTS2823和AS1890。菌体内受缺氧诱导表达增加的是MTS2823、MTS1338、MTS0997和G2。其中MTS1338与G2的启动子区发现了DosR的结合基序。无论是否缺氧,MTS0997、G2、Mcr7和AS1890在菌体外的相对表达量均高于菌体内,而C8只在缺氧时菌体外表达增高。研究揭示了BCG菌体内外sRNA表达谱不同,且一部分sRNA在常规培养和缺氧应激时向菌体外释放,同时发现了细菌受缺氧诱导的sRNA种类。

不同剂量卡介苗膀胱灌注联合中药治疗浅表性膀胱肿瘤术后临床观察

目的：观察不同剂量卡介苗膀胱灌注联合中药治疗浅表性膀胱肿瘤术后患者的复发与不良反应情况。方法：将198例浅表性膀胱肿瘤术后患者按卡介苗灌注剂量分为3组,分别接受120 mg、60 mg和30 mg 3种不同剂量的卡介苗膀胱灌注,随访6~24月,选取临床和随访资料完整的病例,观察肿瘤复发和不良反应发生情况。结果：60 mg组患者的膀胱灌注不良反应较120mg组轻（P〈0.05）,肿瘤复发率低于30 mg组（P〈0.05）。结论：卡介苗灌注剂量为60 mg时不良反应更轻,肿瘤复发率更低。

p300乙酰化在卡介苗感染中的作用

研究p300乙酰化在卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染中的作用。构建THP-1巨噬细胞模型,比较BCG感染前后p300蛋白表达水平和组蛋白H3乙酰化水平的改变,加入p300特异性抑制剂Delphinidin,观察细胞内组蛋白H3乙酰化水平的变化。结果表明,在分化成熟的THP-1细胞系中,BCG感染能够上调p300蛋白表达水平和组蛋白H3乙酰化水平,加入p300特异性抑制剂Delphinidin后,组蛋白H3乙酰化水平降低。BCG感染通过p300途径导致蛋白质乙酰化水平发生改变。

6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)抑制巨噬细胞的自噬并促进BCG的增殖

目的 6 kD早期分泌型抗原靶点(ESAT6)能够促进卡介苗(BCG)的增殖,巨噬细胞的自噬功能能有效杀伤BCG,研究ESAT6与自噬的相互作用,为揭示ESAT6介导的免疫逃逸提供实验依据。方法分别观察对照质粒pCMV-HA和重组质粒pCMV-HA-ESAT6转染以及Earle平衡盐溶液(EBSS)处理的小鼠RAW264.7巨噬细胞中BCG的生长情况,Western blot法检测转染pCMV-HA-ESAT6的RAW264.7细胞0、8、12、24、32 h后,微管相关蛋白1轻链3(LC3)蛋白水平。转染pCMV-HA、pCMV-HA-ESAT6、氯喹(CQ)单独处理和CQ与pCMV-HA-ESAT6转染联合处理条件下,Western blot法检测LC3的水平,Lyso Tracker Red染料法计数溶酶体数量,观察罗琴培养基上BCG的情况。结果 pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中BCG的生长旺盛,而EBSS处理组生长受抑制;在0、8、12、24、32 h,pCMV-HA-ESAT6转染的RAW264.7细胞中LC3Ⅰ向LC3Ⅱ转换逐渐增强;与对照组相比,溶酶体荧光探针Lyso Tracker Red染色法显示pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的溶酶体较多且体积大,但后三组间均无显著性差异;pCMV-HA-ESAT6、CQ以及CQ与pCMV-HA-ESAT6转染处理组的BCG生长旺盛。结论 ESAT6抑制RAW264.7细胞内的自噬水平,并且能够促进RAW264.7细胞中感染BCG的生长。

卡介苗诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化与上调CD36表达有关

目的探讨卡介苗(BCG)感染对小鼠RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响以及引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的相关机制。方法培养RAW264.7巨噬细胞,40μg/mL氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)预处理30 min,按BCG∶RAW264.7巨噬细胞=1∶1、5∶1、10∶1、20∶1比例感染RAW264.7巨噬细胞24 h,油红O染色法检测不同感染比例的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响,以确定BCG感染诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化形成的最适感染比例。接着分别用热灭活和未灭活的BCG以最适感染比例感染RAW264.7巨噬细胞,感染24h后分别对各组细胞进行油红O染色和提取RNA,探讨不同活力的BCG感染对RAW264.7巨噬细胞泡沫化的影响和对RAW264.7巨噬细胞脂质摄入相关受体清道夫受体A1(SR-A1)、低密度脂蛋白受体(LDLR)、CD36的mRNA表达水平的影响。结果不同感染比例的BCG均可诱导RAW264.7巨噬细胞发生泡沫样改变,其中以10∶1的感染比例最为明显。灭活BCG与未灭活BCG均引起RAW264.7巨噬细胞泡沫化,其中未灭活的BCG感染组RAW264.7巨噬细胞泡沫化更为显著。与未感染组相比,BCG感染24 h后,CD36 mRNA的表达显著上调,且上调程度与RAW264.7巨噬细胞泡沫化程度相关。结论BCG诱导巨噬细胞泡沫化形成可能与CD36的表达上调有关。

9578例新生儿卡介苗接种后12周阳转率调查

[目的]探讨本市区近5年新生儿卡介苗(BCG)接种工作的质量情况和BCG补种对提高免疫效果的实际价值。[方法]新生儿卡介苗接种后12周,用结核菌素(PPD)皮试,72h后记录皮试反应结果和卡痕大小,阴性者补种BCG。[结果]统计分析9578例,阳性率95.1%,卡痕率98.3%,PPD反应平均直径9.8±3.4mm,卡痕平均直径4.7±1.3mm,随着卡痕增大阳转率依序提高。[结论]本市区新生儿BCG接种工作质量已达较高水平,多种监测指标均稳定达标。