卡波氏肉瘤病毒K9基因重组慢病毒表达载体的构建及其编码蛋白功能初探

目的:构建卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)K9基因的重组慢病毒载体,并探究K9基因编码的病毒干扰素调节因子1(viral IFN regulatory factor 1,v IRF1)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖的影响。方法:根据K9基因的核酸序列设计聚合酶链式反应(PCR)的上下游引物。以实验室已有的真核表达载体p CI-K9-Flag为模板,PCR扩增K9基因序列。PCR产物经限制性内切酶双酶切后插入慢病毒载体p HAGE-CMVMCS-Izs-Green(简称p HAGE)中,构建重组慢病毒质粒p HAGE-K9。将p HAGE-K9质粒与包膜质粒p MD2.G、包装质粒ps PAX2共同转染人胚肾上皮细胞(293 T细胞),包装K9基因的重组慢病毒。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。慢病毒感染HUVECs后,观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,蛋白质印迹法检测HUVECs中K9编码的v IRF1蛋白的表达。采用流式分选技术获得稳定表达v IRF1蛋白的HUVECs。运用细胞增殖实验检测v IRF1对HUVECs增殖的影响。结果:核酸序列测定结果表明,重组慢病毒质粒p HAGE-K9构建成功。蛋白质印迹结果显示,K9基因重组慢病毒感染HUVECs后其编码蛋白成功表达。细胞增殖实验结果表明,稳定表达v IRF1的HUVECs增殖能力显著强于对照组。结论:KSHV K9基因编码的v IRF1能够促进HUVECs的增殖。

卡波氏肉瘤病毒编码的miR-K7-3p重组慢病毒载体构建及其对血管内皮细胞增殖的影响

目的:构建卡波氏肉瘤病毒(KSHV)编码的miR-K7-3p的重组慢病毒载体,并检测其对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖能力的影响。方法:将miR-K7-3p的序列及互补序列插入miR-30茎环结构,以此为模板扩增出目的片段,插入慢病毒载体mp CDH-CMV-MCS-EF1-tRFP(简写为mp CDH,tRFP基因可表达红色荧光蛋白)中,构建重组慢病毒载体mp CDH-miR-K7-3p。将构建的目的质粒mp CDH-K7-3p与包装质粒ps PAX2、包膜质粒p MD2.G共同转染人胚肾上皮细胞(293 T),包装表达miR-K7-3p的慢病毒。采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。用包装成功的miR-K7-3p慢病毒感染HUVECs,荧光实时定量PCR(qRT-PCR)检测miR-K7-3p的表达,CCK-8及平板克隆实验检测细胞增殖力。结果:双酶切鉴定、核酸序列测定与比对结果证实重组慢病毒质粒mp CDH-miR-K7-3p构建成功。qRT-PCR检测到重组慢病毒感染的HUVECs中miR-K7-3p的表达水平升高。增殖实验结果显示,miR-K7-3p慢病毒感染后的HUVECs增殖能力明显强于对照组。结论:miR-K7-3p可以明显促进HUVECs的增殖。

潜伏相关核抗原在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染过程中的作用

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是卡波氏肉瘤(KS)的致病因素。在潜伏相关核抗原(LANA)影响下,KSHV侵入宿主细胞后早期便会出现一系列病理性活动,但目前尚无有效的早期治疗方案。该文对LANA在KSHV感染过程中的相关机制进行综述,有助于阐明LANA蛋白在KS发病机制中的具体过程,为KS潜伏期治疗提供参考。

安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的血清阳性率研究

目的研究安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在普通人群中的感染情况,并初步分析KSHV感染的危险因子。方法选择KSHV ORF65、ORF73和K8.1编码的病毒蛋白为抗原,采用酶联免疫法对1 008份普通人群血清进行了KSHV抗体检测。结果在检测的1 008份血样中,KSHV抗体的总阳性率为4.3%,其中男为3.9%,女为4.6%。统计学分析结果显示,KSHV感染率没有性别差异,在年龄上也基本无差异。结论在中国安徽北部地区的普通人群KSHV的感染率较低,且KSHV的感染与年龄及性别之间无明显相关性。

湖北地区普通人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)可导致人类产生卡波氏肉瘤(KS),即AIDS病人最为常见的肿瘤。广泛的流行病学研究显示,KSHV的流行与KS相似并呈现明显的地域分布型。为调查KSHV在汉族普通人群中的感染情况,我们以KSHVORF65编码的小衣壳蛋白(smallcapsidprotein)为抗原,采用酶联免疫(ELISA)分析方法,对湖北地区560例汉族普通人群血清样品进行了KSHV抗体检测。在检测的560份血样中,KSHV抗体总阳性率为5.2%,其中,男性阳性率为5.7%,女性为4.5%。统计学分析显示,KSHV感染率在男女性别上无差异(P=0.542),但与年龄有一定的相关性:10岁以下儿童群体较之10岁以上人群KSHV感染率具有显著的统计学差异(P=0.006,OR=6.692,95%CI=1.710-26.198);60岁以上的老年人群KSHV感染率有上升趋势,但无统计学明显差异(P=0.052)。上述结果表明,KSHV在这一地区的流行与西方成年人群的感染率相似,但在儿童群体中的相对较高的感染率与一些非洲地区的接近。由此提示在该群体可能存在特殊的传播模式。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒vGPCR具有巯基化酪氨酸的氨基端的表达和纯化(英文)

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码的G-蛋白偶联受体(vGPCR)基因是一种癌基因,在KSHV致瘤过程中起着重要作用.前期工作揭示vGPCR的氨基端Y26和Y28两位酪氨酸的巯基化作用对其致瘤性至关重要.本研究将vGPCR的氨基端(1～49位氨基酸)以及其yydd突变体分别同鼠Fc片段有机连接并命名为wt-vG-N-mFc和yydd-vG-N-mFc.采用该两种重组质粒分别转染HEK293T细胞,重组融合蛋白分别从全细胞裂解液和细胞培养液中被纯化出来,并被考马斯亮蓝和印迹杂交鉴定.放射自显影表明wt-vG-N-mFc而非yydd-vG-N-mFc具有巯基化修饰作用.含有巯基化酪氨酸的vGPCR氨基端融合蛋白的成功表达和纯化为其将来在研究vGPCR的致瘤性和以vG-PCR为靶定目标的临床治疗中的应用打下了基础.

百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒DNA的套式PCR检测

目的了解百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的流行状况。方法收集百色市部分无偿献血者肘静脉抗凝血474份,其中男259份,女215份,采用套式聚合酶链反应(n-PCR)方法对474例样本所提取的DNA进行KSHV特异性序列扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳,出现168bp条带为阳性结果。结果 474名献血者中9例阳性,阳性率1.90%;其中男性献血者中检出阳性者5例,阳性率为1.93%;女性献血者中检出4例,阳性率为1.86%。男女两组间阳性率采用χ2检验,差异无统计学意义(P>0.05)。结论百色市献血人群中存在KSHV的感染,不同性别献血者感染率差异无显著性。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF65抗体的制备及其特异性检测

目的制备高效价卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)病毒ORF65衣壳蛋白抗体并检测其特异性。方法将人工合成的ORF65蛋白抗原肽经弗氏佐剂乳化,在家兔背部、颌下等皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共4次。末次免疫后1周取兔血清,ELISA法检测兔免疫血清抗体IgG抗体水平。进一步采用免疫荧光、Western blot检测制备的抗血清中与ORF65结合的特异性。结果家兔在全程免疫后产生了高效价的特异性抗体,最高滴度达1∶12 800。免疫荧光检测显示,与未经佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞相比,兔抗血清主要结合于BCBL-1细胞胞质,与ORF65蛋白在细胞内表达位置一致。Western blot结果显示在21kD处有特异性蛋白条带,其大小与预期的ORF65蛋白大小相符,同时经TPA刺激的BCBL-1细胞中ORF65蛋白表达量高于对照组,与ORF65蛋白裂解期蛋白的特性相符。结论用ORF65衣壳蛋白抗原肽段免疫家兔,可成功制备高效价的特异性抗血清,该抗体可与KSHV病毒ORF65蛋白特异性结合。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染神经元细胞SH-SY5Y的特点研究

为检测卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma associated herpesvirus,KSHV)是否能够直接感染神经元SH-SY5Y细胞,分析病毒相关基因的表达水平和细胞增殖情况等特点,为进一步研究KSHV感染在中枢神经系统疾病中的作用提供依据。采用佛波酯(12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA)从BCBL1细胞中诱导并提取有感染性的KSHV病毒,感染神经元细胞SH-SY5Y,48 h后显微镜下观察细胞形态变化。提取感染细胞的RNA,通过RT-PCR技术检测裂解态的ORF26和潜伏态的潜伏相关核抗原(Latency Associated Nuclear Antigen,LANA)的m RNA表达水平,通过免疫荧光检测LANA蛋白的表达水平,验证KSHV的成功感染,并在感染后1、3、5、7 d进行细胞计数,与未感染的细胞做比较,以检测KSHV感染对细胞增殖能力的影响。结果显示,显微镜下观察KSHV感染与未感染的SH-SY5Y细胞形态,见未感染的SH-SY5Y细胞呈梭形聚团生长,感染KSHV后,细胞变大,形态变圆,倾向于分散生长。RT-PCR检测发现ORF26和LANA在KSHV感染的SH-SY5Y细胞中均有表达。由此可知,免疫荧光检测到LANA蛋白在细胞中也有表达,这些结果确定了KSHV可以成功感染SH-SY5Y细胞,并可同时表达潜伏态和裂解态的病毒基因。细胞计数结果表明KSHV感染促进了SH-SY5Y细胞的增殖能力。

利托那韦对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染细胞LYN表达的影响

目的探讨蛋白酶抑制剂利托那韦对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus,KSHV)感染细胞LYN表达的影响。方法原代培养人脐静脉内皮细胞HUVECs,从BCBL-1中提取KSHV病毒感染HUVECs,PCR扩增KS330233证实感染成功。CCK8法测定半数抑制浓度,CCK8法检测细胞增殖能力,Western blot检测LYN表达及p-PI3K和p-AKT水平。结果 RTV作用于细胞的IC_(50)为25μmol/L。RTV与LYN抑制剂PP2能抑制KSHV感染的HUVECs的增殖和LYN、p-PI3K和p-AKT的表达(P<0.05)。结论 RTV可通过抑制LYN及其下游的PI3K/AKT信号通路抑制KSHV感染细胞HUVECs的增殖。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF50结合蛋白的筛选

应用酵母双杂交系统,以包含RTA氮端530个氨基酸的片段插入载体pGBKT7作为诱铒,在人脾脏cDNA文库中,筛选得到4个阳性AD/文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与RTA的相互作用.将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是:TLE2、RBP-Jk、ZNF-12和WHSC1.

湖北荆州地区普通人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学调查

目的:探讨湖北荆州地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的感染与地域、性别和年龄的关系。方法:随机收集湖北荆州地区普通人群血清1281例,行ELISA检测LANA、裂解期蛋白ORF65和ORFK8.1的重组蛋白。结果:该地区总体KSHV感染率低于我国新疆地区(7.3%vs19.2%,P<0.05);女性感染KSHV的比例大于男性(9.2%vs5.6%,P<0.05);小于20岁,20～50岁以及50岁以上的KSHV感染率分别为7.2%、7.4%和7.2%(P>0.05)。逻辑回归分析表明在湖北公安地区HBV感染与KSHV的感染不具有相关性(OR1.177,95%CI0.79～1.753,P<0.05)。结论:KSHV的感染存在明显的地域差别,女性KSHV抗体阳性率高于男性,而与年龄无关。

IκBα显性负相重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证

目的:构建表达IκBα显性负相结构(dominant-negative construct,IκBα-DN)的重组慢病毒载体,并检测其对核转录因子-κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法:PCR扩增IκBα-DN片段并插入至p CDHCMV-MCS-EF1-cop GFP载体中。将构建的p CDH-IκBα-DN重组质粒与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,并用梯度稀释法检测病毒滴度。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,通过免疫印迹检测IκBα蛋白的表达量。将慢病毒IκBα-DN感染已转染有NF-κB虫荧光素酶报告质粒的293 T细胞,24 h后检测IκBα-DN对NF-κB活性的影响。进一步用慢病毒IκBα-DN感染表达卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)编码的病毒FLICE抑制蛋白(viral FLICE inhibitory protein,v FLIP)的人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),以检测IκBα-DN在NF-κB信号通路中的功能。结果:限制性内切酶鉴定以及核酸序列比对证实重组质粒p CDH-IκBα-DN构建成功。通过三质粒包装系统包装表达IκBα-DN的重组慢病毒,病毒滴度约为3×107efu/m L。以慢病毒IκBα-DN感染293 T细胞,免疫印迹结果表明胞质中IκBα蛋白的表达量明显升高。虫荧光素酶报告实验结果提示,重组慢病毒介导的IκBα-DN能有效抑制NF-κB的活性。在表达KSHV v FLIP的HUVECs中,IκBα-DN也能显著减弱NF-κB通路信号。结论:成功构建的含IκBα-DN序列的慢病毒能够有效地感染293 T细胞和内皮细胞,且初步结果提示IκBα-DN能增加胞质内IκBα的含量,并进一步抑制NF-κB信号的传递。

Notch1蛋白胞内段重组慢病毒载体的构建及其在原发性渗出性淋巴瘤细胞中的功能验证

目的:构建含Notch1胞内段(intracellular Notch1,ICN)基因的重组慢病毒载体,并检测其对Notch信号通路以及卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)潜伏感染的原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞增殖能力的影响。方法:从真核表达质粒pIP-Flag-ICN中扩增出ICN基因片段,并将其插入慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-Izs Green(pHAGE)质粒中以构建重组质粒pHAGE-ICN。在人胚肾上皮细胞293T细胞中共转染重组质粒pHAGE-ICN、包装质粒psPAX2和包膜质粒p MD2.G,获得表达ICN的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度。以ICN重组慢病毒感染PEL细胞系BCP-1细胞,通过蛋白质印迹法检测ICN以及Notch信号通路下游靶蛋白的表达,采用细胞计数法检测过表达ICN对BCP-1细胞增殖能力的影响。结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pHAGE-ICN构建成功。通过慢病毒三质粒包装系统成功包装携带ICN基因的重组慢病毒,并经梯度稀释法测得病毒滴度约为2×10~7TU/mL。以ICN重组慢病毒感染BCP-1细胞,蛋白质印迹证实ICN蛋白获得有效过表达,并且能够促进Notch信号通路下游靶蛋白Hes-1的表达。细胞计数结果显示,过表达ICN能显著增强BCP-1细胞的增殖能力。结论:成功构建了含ICN基因的重组慢病毒载体,重组慢病毒介导的ICN过表达能够增强Notch信号通路活性,并增强PEL细胞的增殖能力。

重组慢病毒载体介导KSHV分子开关蛋白Rta在BCBL-1细胞中的表达及其功能鉴定

目的:构建含卡波氏肉瘤病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)分子开关蛋白,即复制和转录激活蛋白(replication and transcriptional activator,Rta)基因的重组慢病毒载体。方法:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta中扩增出Rta基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中,构建重组慢病毒载体pHAGE-Rta。将重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293 T细胞,通过荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的293 T细胞占总数的百分比。收集病毒悬液,采用梯度稀释法测定病毒滴度。以不同感染复数(MOI)的Lentivirus-Rta病毒量感染BCBL-1细胞,72 h后检测Rta基因的表达,同时通过蛋白质印迹和病毒颗粒释放实验检测KSHV裂解期蛋白病毒白细胞介素-6(vIL-6)的表达及子代病毒颗粒的产出。结果:从真核表达质粒pcDNA3.1-Rta中扩增出Rta基因,插入pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen后,酶切鉴定和核酸序列测定证实重组慢病毒骨架质粒pHAGE-Rta构建成功。通过慢病毒包装3质粒表达系统获得了表达Rta基因的重组慢病毒,滴度约为2×107efu/mL。以不同MOI的重组慢病毒感染BCBL-1细胞,72 h后可检测到外源基因编码Rta蛋白的表达,且其表达能够上调KSHV vIL-6的表达水平及促进子代病毒颗粒的释放。结论:成功构建了含Rta基因的慢病毒表达载体,获得的重组病毒能够有效地感染BCBL-1细胞,并发挥激活KSHV裂解期复制的生物学功能。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒亚型分析研究

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒为双链DNA病毒,基因组全长为160～170 kb。该病毒基因最早于1994年由美国哥伦比亚大学病理学家Chang等用代表性差异分析法首先在艾滋病患者并发的卡波氏肉瘤组织中发现。常用于KSHV亚型分析的基因片段有:ORF26、ORF75、K1、K15等。基于ORF26分型,最初采用的是330 bp和233 bp的ORF26基因片段,可将KSHV分为A、B、C三个亚型。目前,根据K1基因的多态性,主要将KSHV分为A、B、C、D、E、F亚型,各亚型在氨基酸水平上具有15%～30%的区别。目前,已知的K15有3个等位基因,分别是:P亚型、M亚型和N亚型。其中,N亚型与M型的核苷酸水平差异则高达90%。基于ORF75可以将KSHV分为A、B、C及N亚型。其中,A亚型主要流行于经典的KS患者,而B、C亚型主要见于非洲地区,同时所有亚型都在美国AIDS相关的KS患者中有发现。

男男性接触者人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的流行病学研究现状

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒,又称为人类疱疹病毒8型,是1994年发现的一种新型病毒,可引起包括卡波氏肉瘤在内的多种恶性肿瘤。目前对其致病及感染机制尚不明确。研究表明,男男性接触者(MSM)人群是卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的高危人群。近十余年来国际上对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒已进行较为广泛的研究,并在MSM人群中开展了深入的流行病学调查,了解该人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的感染率,并分析其相关危险因素如多个性伴侣、无保护性行为及艾滋病等性病史。本文对近年来MSM人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的流行病学研究结果进行一次回顾性综述。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)vIL-6通过IRF-3负性调控IFN-β转录表达

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),又称人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8),是艾滋病感染者中发病率最高的肿瘤-卡波氏肉瘤的致病性病原体。本实验对KSHV裂解期蛋白-病毒白细胞介素6(Viral interleukin-6,vIL-6)抑制宿主固有免疫机制进行初步探讨。利用仙台病毒刺激人胚肾细胞(HEK293T)激活抗病毒固有免疫,观察vIL-6过表达后对IFN-β的作用及机制,利用实时定量PCR检测IFN-β基因表达及双荧光素酶实验分析IFN-β基因启动子的活性。过表达vIL-6后,IFN-β基因mRNA水平表达明显下降,进一步实验证明vIL-6可抑制IFN-β基因启动子活性,且vIL-6可特异性作用于IFN-β基因启动子PRDIII-PRDI区。本研究首次证实了KSHV vIL-6可通过抑制IFN-β启动子活性从而调控IFN-β表达,且这种作用主要通过IRF-3信号途径。