潜伏相关核抗原在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染过程中的作用

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是卡波氏肉瘤(KS)的致病因素。在潜伏相关核抗原(LANA)影响下,KSHV侵入宿主细胞后早期便会出现一系列病理性活动,但目前尚无有效的早期治疗方案。该文对LANA在KSHV感染过程中的相关机制进行综述,有助于阐明LANA蛋白在KS发病机制中的具体过程,为KS潜伏期治疗提供参考。

安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的血清阳性率研究

目的研究安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在普通人群中的感染情况,并初步分析KSHV感染的危险因子。方法选择KSHV ORF65、ORF73和K8.1编码的病毒蛋白为抗原,采用酶联免疫法对1 008份普通人群血清进行了KSHV抗体检测。结果在检测的1 008份血样中,KSHV抗体的总阳性率为4.3%,其中男为3.9%,女为4.6%。统计学分析结果显示,KSHV感染率没有性别差异,在年龄上也基本无差异。结论在中国安徽北部地区的普通人群KSHV的感染率较低,且KSHV的感染与年龄及性别之间无明显相关性。

湖北地区普通人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)可导致人类产生卡波氏肉瘤(KS),即AIDS病人最为常见的肿瘤。广泛的流行病学研究显示,KSHV的流行与KS相似并呈现明显的地域分布型。为调查KSHV在汉族普通人群中的感染情况,我们以KSHVORF65编码的小衣壳蛋白(smallcapsidprotein)为抗原,采用酶联免疫(ELISA)分析方法,对湖北地区560例汉族普通人群血清样品进行了KSHV抗体检测。在检测的560份血样中,KSHV抗体总阳性率为5.2%,其中,男性阳性率为5.7%,女性为4.5%。统计学分析显示,KSHV感染率在男女性别上无差异(P=0.542),但与年龄有一定的相关性:10岁以下儿童群体较之10岁以上人群KSHV感染率具有显著的统计学差异(P=0.006,OR=6.692,95%CI=1.710-26.198);60岁以上的老年人群KSHV感染率有上升趋势,但无统计学明显差异(P=0.052)。上述结果表明,KSHV在这一地区的流行与西方成年人群的感染率相似,但在儿童群体中的相对较高的感染率与一些非洲地区的接近。由此提示在该群体可能存在特殊的传播模式。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒vGPCR具有巯基化酪氨酸的氨基端的表达和纯化(英文)

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码的G-蛋白偶联受体(vGPCR)基因是一种癌基因,在KSHV致瘤过程中起着重要作用.前期工作揭示vGPCR的氨基端Y26和Y28两位酪氨酸的巯基化作用对其致瘤性至关重要.本研究将vGPCR的氨基端(1～49位氨基酸)以及其yydd突变体分别同鼠Fc片段有机连接并命名为wt-vG-N-mFc和yydd-vG-N-mFc.采用该两种重组质粒分别转染HEK293T细胞,重组融合蛋白分别从全细胞裂解液和细胞培养液中被纯化出来,并被考马斯亮蓝和印迹杂交鉴定.放射自显影表明wt-vG-N-mFc而非yydd-vG-N-mFc具有巯基化修饰作用.含有巯基化酪氨酸的vGPCR氨基端融合蛋白的成功表达和纯化为其将来在研究vGPCR的致瘤性和以vG-PCR为靶定目标的临床治疗中的应用打下了基础.

百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒DNA的套式PCR检测

目的了解百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的流行状况。方法收集百色市部分无偿献血者肘静脉抗凝血474份,其中男259份,女215份,采用套式聚合酶链反应(n-PCR)方法对474例样本所提取的DNA进行KSHV特异性序列扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳,出现168bp条带为阳性结果。结果 474名献血者中9例阳性,阳性率1.90%;其中男性献血者中检出阳性者5例,阳性率为1.93%;女性献血者中检出4例,阳性率为1.86%。男女两组间阳性率采用χ2检验,差异无统计学意义(P>0.05)。结论百色市献血人群中存在KSHV的感染,不同性别献血者感染率差异无显著性。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF65抗体的制备及其特异性检测

目的制备高效价卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)病毒ORF65衣壳蛋白抗体并检测其特异性。方法将人工合成的ORF65蛋白抗原肽经弗氏佐剂乳化,在家兔背部、颌下等皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共4次。末次免疫后1周取兔血清,ELISA法检测兔免疫血清抗体IgG抗体水平。进一步采用免疫荧光、Western blot检测制备的抗血清中与ORF65结合的特异性。结果家兔在全程免疫后产生了高效价的特异性抗体,最高滴度达1∶12 800。免疫荧光检测显示,与未经佛波酯(TPA)刺激的BCBL-1细胞相比,兔抗血清主要结合于BCBL-1细胞胞质,与ORF65蛋白在细胞内表达位置一致。Western blot结果显示在21kD处有特异性蛋白条带,其大小与预期的ORF65蛋白大小相符,同时经TPA刺激的BCBL-1细胞中ORF65蛋白表达量高于对照组,与ORF65蛋白裂解期蛋白的特性相符。结论用ORF65衣壳蛋白抗原肽段免疫家兔,可成功制备高效价的特异性抗血清,该抗体可与KSHV病毒ORF65蛋白特异性结合。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染神经元细胞SH-SY5Y的特点研究

为检测卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma associated herpesvirus,KSHV)是否能够直接感染神经元SH-SY5Y细胞,分析病毒相关基因的表达水平和细胞增殖情况等特点,为进一步研究KSHV感染在中枢神经系统疾病中的作用提供依据。采用佛波酯(12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate,TPA)从BCBL1细胞中诱导并提取有感染性的KSHV病毒,感染神经元细胞SH-SY5Y,48 h后显微镜下观察细胞形态变化。提取感染细胞的RNA,通过RT-PCR技术检测裂解态的ORF26和潜伏态的潜伏相关核抗原(Latency Associated Nuclear Antigen,LANA)的m RNA表达水平,通过免疫荧光检测LANA蛋白的表达水平,验证KSHV的成功感染,并在感染后1、3、5、7 d进行细胞计数,与未感染的细胞做比较,以检测KSHV感染对细胞增殖能力的影响。结果显示,显微镜下观察KSHV感染与未感染的SH-SY5Y细胞形态,见未感染的SH-SY5Y细胞呈梭形聚团生长,感染KSHV后,细胞变大,形态变圆,倾向于分散生长。RT-PCR检测发现ORF26和LANA在KSHV感染的SH-SY5Y细胞中均有表达。由此可知,免疫荧光检测到LANA蛋白在细胞中也有表达,这些结果确定了KSHV可以成功感染SH-SY5Y细胞,并可同时表达潜伏态和裂解态的病毒基因。细胞计数结果表明KSHV感染促进了SH-SY5Y细胞的增殖能力。

利托那韦对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染细胞LYN表达的影响

目的探讨蛋白酶抑制剂利托那韦对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus,KSHV)感染细胞LYN表达的影响。方法原代培养人脐静脉内皮细胞HUVECs,从BCBL-1中提取KSHV病毒感染HUVECs,PCR扩增KS330233证实感染成功。CCK8法测定半数抑制浓度,CCK8法检测细胞增殖能力,Western blot检测LYN表达及p-PI3K和p-AKT水平。结果 RTV作用于细胞的IC_(50)为25μmol/L。RTV与LYN抑制剂PP2能抑制KSHV感染的HUVECs的增殖和LYN、p-PI3K和p-AKT的表达(P<0.05)。结论 RTV可通过抑制LYN及其下游的PI3K/AKT信号通路抑制KSHV感染细胞HUVECs的增殖。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒ORF50结合蛋白的筛选

应用酵母双杂交系统,以包含RTA氮端530个氨基酸的片段插入载体pGBKT7作为诱铒,在人脾脏cDNA文库中,筛选得到4个阳性AD/文库质粒,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD/文库质粒与RTA的相互作用.将阳性AD/文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析,发现它们分别是:TLE2、RBP-Jk、ZNF-12和WHSC1.

湖北荆州地区普通人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学调查

目的:探讨湖北荆州地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的感染与地域、性别和年龄的关系。方法:随机收集湖北荆州地区普通人群血清1281例,行ELISA检测LANA、裂解期蛋白ORF65和ORFK8.1的重组蛋白。结果:该地区总体KSHV感染率低于我国新疆地区(7.3%vs19.2%,P<0.05);女性感染KSHV的比例大于男性(9.2%vs5.6%,P<0.05);小于20岁,20～50岁以及50岁以上的KSHV感染率分别为7.2%、7.4%和7.2%(P>0.05)。逻辑回归分析表明在湖北公安地区HBV感染与KSHV的感染不具有相关性(OR1.177,95%CI0.79～1.753,P<0.05)。结论:KSHV的感染存在明显的地域差别,女性KSHV抗体阳性率高于男性,而与年龄无关。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒亚型分析研究

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒为双链DNA病毒,基因组全长为160～170 kb。该病毒基因最早于1994年由美国哥伦比亚大学病理学家Chang等用代表性差异分析法首先在艾滋病患者并发的卡波氏肉瘤组织中发现。常用于KSHV亚型分析的基因片段有:ORF26、ORF75、K1、K15等。基于ORF26分型,最初采用的是330 bp和233 bp的ORF26基因片段,可将KSHV分为A、B、C三个亚型。目前,根据K1基因的多态性,主要将KSHV分为A、B、C、D、E、F亚型,各亚型在氨基酸水平上具有15%～30%的区别。目前,已知的K15有3个等位基因,分别是:P亚型、M亚型和N亚型。其中,N亚型与M型的核苷酸水平差异则高达90%。基于ORF75可以将KSHV分为A、B、C及N亚型。其中,A亚型主要流行于经典的KS患者,而B、C亚型主要见于非洲地区,同时所有亚型都在美国AIDS相关的KS患者中有发现。

男男性接触者人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的流行病学研究现状

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒,又称为人类疱疹病毒8型,是1994年发现的一种新型病毒,可引起包括卡波氏肉瘤在内的多种恶性肿瘤。目前对其致病及感染机制尚不明确。研究表明,男男性接触者(MSM)人群是卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的高危人群。近十余年来国际上对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒已进行较为广泛的研究,并在MSM人群中开展了深入的流行病学调查,了解该人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的感染率,并分析其相关危险因素如多个性伴侣、无保护性行为及艾滋病等性病史。本文对近年来MSM人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的流行病学研究结果进行一次回顾性综述。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)vIL-6通过IRF-3负性调控IFN-β转录表达

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV),又称人类疱疹病毒8型(Human herpesvirus 8,HHV-8),是艾滋病感染者中发病率最高的肿瘤-卡波氏肉瘤的致病性病原体。本实验对KSHV裂解期蛋白-病毒白细胞介素6(Viral interleukin-6,vIL-6)抑制宿主固有免疫机制进行初步探讨。利用仙台病毒刺激人胚肾细胞(HEK293T)激活抗病毒固有免疫,观察vIL-6过表达后对IFN-β的作用及机制,利用实时定量PCR检测IFN-β基因表达及双荧光素酶实验分析IFN-β基因启动子的活性。过表达vIL-6后,IFN-β基因mRNA水平表达明显下降,进一步实验证明vIL-6可抑制IFN-β基因启动子活性,且vIL-6可特异性作用于IFN-β基因启动子PRDIII-PRDI区。本研究首次证实了KSHV vIL-6可通过抑制IFN-β启动子活性从而调控IFN-β表达,且这种作用主要通过IRF-3信号途径。

安徽北部地区恶性肿瘤人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒血清学分析

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒是一种新发现的γ疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)。在中国新疆,KSHV感染率比较高,KSHV在免疫缺陷患者和静脉吸毒者中感染率也比在普通人群中高。为了进一步研究KSHV在安徽北部地区恶性肿瘤人群中的感染率和高风险因素,初步探讨KSHV与肿瘤的发生之间相关性,研究KSHV的高发人群特点,本研究选用KSHV病毒重组蛋白ORF65、ORF 73和K8.1为抗原,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)对500份恶性肿瘤患者血清样本及200份健康体检人群血清样本进行KSHV抗体检测,分析KSHV的感染率及危险因素。结果显示500例肿瘤患者KSHV阳性总数170例,总阳性率为34%,200份健康人群KSHV阳性总数22例,总阳性率为11%,肿瘤人群KSHV阳性率明显高于健康人群(P<0.001)。其中肺癌、肝癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌样本KSHV阳性率分别为36.4%,34.1%,41.7%,28.6%,30.3%,此5组肿瘤组KSHV阳性率也分别高于健康人群,都具有统计学意义(P<0.001)。但5组肿瘤样本之间KSHV阳性率无明显差异(P>0.05),且各组肿瘤样本分别与性别、乙肝五项、丙肝之间无统计学意义(P>0.05)。本研究结果提示安徽北部地区恶性肿瘤患者KSHV抗体阳性率显著高于中国普通人群总体KSHV抗体阳性率,证明KSHV在恶性肿瘤人群中呈现较高比例的分布。

下调LANA对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒复制的影响

本文旨在探讨下调潜伏相关核抗原(Latency-associated nuclear antigen,LANA)对卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma associated herpesvirus,KSHV)复制的影响。以四环素(Doxycycline,DOX)处理KSHV阳性的iSLK.219细胞,在不同时间点收集细胞,采用实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR,qPCR)检测裂解复制期LANA mRNA表达水平。采用脂质体法转染si-LANA至iSLK.219细胞中下调LANA表达水平,以转染非特异siRNA为对照,24h后加入DOX激活病毒裂解复制,在裂解复制激活后不同时间点收集细胞和培养液上清。采用台盼蓝染色法检测细胞活力,倒置荧光显微镜观察红色荧光蛋白(Red fluorescence protein,RFP)表达评价KSHV裂解复制水平;qPCR检测细胞内和上清液中KSHV基因组的拷贝数以判断病毒复制水平。诱导KSHV裂解复制后24h和48h LANA表达分别为潜伏期的2.2和2.6倍。敲低LANA后iSLK.219细胞裂解复制水平在24h、48h和72h比未敲低组分别下降了8.18、3.25和3.98倍。敲低LANA细胞内病毒基因组拷贝数没有明显增加,而未敲低组在细胞内病毒基因组拷贝数在72h增加到2.1倍。相较于未敲低组,上清液中的病毒拷贝数在所有时间点均显著减少。对细胞活力的分析显示敲低LANA降低了细胞活力。敲低LANA抑制KSHV裂解复制,LANA可能通过维持细胞存活和增加细胞内病毒基因组拷贝数促进KSHV病毒的裂解复制。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究

目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1(+)。进一步在原有的下游引物5′端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒。将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆。最后用抗flagM2单克隆抗体进行Westernblot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达。结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHVvIL-6基因呈现100%同源性。Westernblot结果显示,在约25ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致。结论:KSHVvIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达。

甘肃省敦煌地区普通人群卡波肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

目的研究卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在甘肃敦煌地区普通人群中的血清阳性率,并分析KSHV感染的危险因素。方法随机收集1 000例敦煌地区普通人群血清,以KSHV 3个基因片段orf65、orf73、orf k8.1编码蛋白为抗原,间接ELISA检测样本中KSHV抗体,SPSS软件分析危险因素。结果 1 000份血清中,KSHV抗体总阳性率为19%,男性阳性率(22.9%)高于女性(16.6%)(P=0.016);KSHV感染与梅毒螺旋体(P=0.004)和丙肝病毒(P=0.027)感染间有相关性,而与年龄、乙肝五项无关。多因素Logistic回归分析显示梅毒螺旋体感染的OR(95%CI)为10.142(1.920~53.577)。结论甘肃敦煌地区普通人群中KSHV的感染率较高,且与性别有关;梅毒螺旋体感染是该地区KSHV感染最重要的独立危险因素。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA,并将其置于真核细胞中进行表达。方法:用K8.1B基因设计一对PCR引物,其5’端分别引入BamHI和XhoI酶切位点。以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增KSHVK8.1B编码序列,经双酶切后克隆进pcDNA3.1(+)载体中,构建含K8.1BcDNA的重组真核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后转染人胚肾293细胞,经G418筛选获细胞克隆。用间接免疫荧光染色(IFA)检测K8.1BcDNA编码蛋白在293细胞中的表达状况。结果:RT-PCR分离、克隆的K8.1BcDNA全长501bp,核酸序列分析显示,该基因与Genbank中已登记的K8.1B编码基因呈现100%同源性。经IFA证实该重组蛋白为KSHVK8.1B特异性蛋白。结论:KSHV包膜糖蛋白K8.1B编码cDNA在293细胞中获得了正确表达。