甘肃省敦煌地区普通人群卡波肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

目的研究卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在甘肃敦煌地区普通人群中的血清阳性率,并分析KSHV感染的危险因素。方法随机收集1 000例敦煌地区普通人群血清,以KSHV 3个基因片段orf65、orf73、orf k8.1编码蛋白为抗原,间接ELISA检测样本中KSHV抗体,SPSS软件分析危险因素。结果 1 000份血清中,KSHV抗体总阳性率为19%,男性阳性率(22.9%)高于女性(16.6%)(P=0.016);KSHV感染与梅毒螺旋体(P=0.004)和丙肝病毒(P=0.027)感染间有相关性,而与年龄、乙肝五项无关。多因素Logistic回归分析显示梅毒螺旋体感染的OR(95%CI)为10.142(1.920~53.577)。结论甘肃敦煌地区普通人群中KSHV的感染率较高,且与性别有关;梅毒螺旋体感染是该地区KSHV感染最重要的独立危险因素。

卡波肉瘤相关疱疹病毒ORFK12蛋白初步研究

目的研究卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)ORFK12基因在大肠杆菌的表达及表达的蛋白在普通人群中检测KSHV的感染情况。方法设计一对特异性引物,以BCBL-1细胞总DNA为模板,采用PCR方法扩增KSHV ORFK12基因。构建含目的基因的重组质粒命名为PQE-80L-K12和诱导蛋白表达。采用ELISA法和Western blot法筛查临床收集的血清标本中感染KSHV的情况。结果异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后的PQE-80L-K12重组菌经十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示有一个约10 ku的融合表达蛋白为ORFK12蛋白。采用ELISA法和Western blot法检测显示ORFK12蛋白能与KSHV阳性血清反应。结论 KSHV ORFK12基因在大肠杆菌中表达,表达的ORFK12蛋白在实验室检测感染KSHV有一定的辅助作用。

安徽省安庆地区卡波肉瘤相关疱疹病毒感染的危险因素分析

目的探讨安徽省安庆地区卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在普通人群中的感染情况,并初步分析KSHV感染的危险因子。方法选择KSHV ORF65、ORF73和K8.1编码的病毒蛋白为抗原,采用酶联免疫法对1 006份普通健康人群血清进行KSHV抗体检测。结果在检测的1 006份血样中,KSHV抗体的总阳性率为5.3%,其中男性为5.6%,女性为5.5%。KSHV感染率与梅毒感染有显著相关性,但是其与年龄、性别、血型及乙肝五项间无明显相关性。结论中国安徽安庆地区的普通健康人群KSHV的感染率较低,其中KSHV的感染率与性病梅毒感染具有显著相关性。

卡波肉瘤相关疱疹病毒细胞抗原片的制备

目的成功制备了卡波肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的细胞抗原片,并验证其有效性,为检测KSHV血清标本提供了一种可行的办法。方法培养了能够稳定表达卡波肉瘤相关疱疹病毒核相关抗原(LANA)的BCBL-1细胞。BCBL-1细胞是感染过KSHV并且细胞基因组中包含KSHV基因的细胞。待细胞生长活力旺盛且状态良好时,收集细胞并用4%的多聚甲醛固定到预先处理好的抗原片上,完成封闭、待测血清的孵育和荧光二抗的孵育后,通过免疫荧光显微镜观察检测结果。结果通过免疫荧光技术发现,感染过KSHV的患者血清样本能观察到荧光标记的二抗激发的荧光,而未感染过KSHV的标本则没有观察到荧光标记的二抗激发的荧光。结论成功制备了能用于检测血清的卡波肉瘤相关疱疹病毒的细胞抗原片,为进一步研究卡波肉瘤相关疱疹病毒的流行病学提供方法。

卡波西肉瘤相关疱疹病毒诱导代谢重编程的致瘤机制研究进展

卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是一种与多种类型人类恶性肿瘤密切相关的致癌γ疱疹病毒。KSHV相关肿瘤的抗病毒药物局限,患者对常用的抗病毒药物存在明显的异质性,且并不总是对KSHV诱发的疾病有效,因此亟需寻找不同分子机制的合适靶点来治疗KSHV相关疾病。KSHV通过基因及编码的致癌蛋白、信号通路直接或间接调控糖酵解代谢与氨基酸代谢,通过促进脂肪酸合成和过氧化物酶体对脂质代谢进行调控,进而促进KSHV潜伏裂解期病毒粒子复制、存活、转化和诱导血管生成等影响肿瘤的发生和治疗效果。此外,靶向KSHV诱导代谢过程中的基因、信号通路、代谢调节因子和代谢物在有关体内体外实验的研究中,有显著的抗病毒和抑瘤效果,表现出具有成为治疗靶点的潜力。对KSHV诱导代谢重编程的致瘤作用及机制的认识可以为其相关疾病的治疗提供理论依据。本文对KSHV诱导糖酵解代谢、氨基酸代谢和脂质代谢发生的异常改变和分子机制,以及基于KSHV诱导代谢重编程的相关潜在治疗靶点进行了综述。

潜伏相关核抗原在卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染过程中的作用

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是卡波氏肉瘤(KS)的致病因素。在潜伏相关核抗原(LANA)影响下,KSHV侵入宿主细胞后早期便会出现一系列病理性活动,但目前尚无有效的早期治疗方案。该文对LANA在KSHV感染过程中的相关机制进行综述,有助于阐明LANA蛋白在KS发病机制中的具体过程,为KS潜伏期治疗提供参考。

安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒的血清阳性率研究

目的研究安徽蚌埠地区卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)在普通人群中的感染情况,并初步分析KSHV感染的危险因子。方法选择KSHV ORF65、ORF73和K8.1编码的病毒蛋白为抗原,采用酶联免疫法对1 008份普通人群血清进行了KSHV抗体检测。结果在检测的1 008份血样中,KSHV抗体的总阳性率为4.3%,其中男为3.9%,女为4.6%。统计学分析结果显示,KSHV感染率没有性别差异,在年龄上也基本无差异。结论在中国安徽北部地区的普通人群KSHV的感染率较低,且KSHV的感染与年龄及性别之间无明显相关性。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒编码IL-6基因的分离克隆及在NIH3T3细胞中的表达研究

目的:分离克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码IL-6基因(vIL-6),并导入NIH3T3细胞中进行真核表达。方法:根据KSHV编码IL-6基因核苷酸序列设计一对引物,在引物的5′端分别引入BamHⅠ、HindⅢ酶切位点,以原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总DNA为模板,PCR扩增vIL-6基因,PCR产物经双酶切克隆进真核载体pcDNA3.1(+)。进一步在原有的下游引物5′端加上一段flag序列,以经过序列测定正确的重组质粒为模板,PCR扩增vIL-6-flag融合基因,构建含vIL-6-flag的重组质粒。将该质粒转染NIH3T3细胞,经G418筛选获细胞抗性克隆。最后用抗flagM2单克隆抗体进行Westernblot检测vIL-6在NIH3T3细胞中的表达。结果:获得vIL-6-flag融合基因,全长671bp,其中vIL-6基因核苷酸序列与GenBank中所登记的KSHVvIL-6基因呈现100%同源性。Westernblot结果显示,在约25ku位置有目的条带,与预期的重组vIL-6-flag融合蛋白大小一致。结论:KSHVvIL-6编码基因在NIH3T3细胞中初步获得表达。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA的克隆及在真核细胞中的表达

目的:分离、克隆卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1B全长cDNA,并将其置于真核细胞中进行表达。方法:用K8.1B基因设计一对PCR引物,其5’端分别引入BamHI和XhoI酶切位点。以佛波酯(TPA)刺激的原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1细胞总RNA为模板,通过RT-PCR扩增KSHVK8.1B编码序列,经双酶切后克隆进pcDNA3.1(+)载体中,构建含K8.1BcDNA的重组真核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定、核酸序列测定和分析后转染人胚肾293细胞,经G418筛选获细胞克隆。用间接免疫荧光染色(IFA)检测K8.1BcDNA编码蛋白在293细胞中的表达状况。结果:RT-PCR分离、克隆的K8.1BcDNA全长501bp,核酸序列分析显示,该基因与Genbank中已登记的K8.1B编码基因呈现100%同源性。经IFA证实该重组蛋白为KSHVK8.1B特异性蛋白。结论:KSHV包膜糖蛋白K8.1B编码cDNA在293细胞中获得了正确表达。

湖北地区普通人群卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学分析

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)可导致人类产生卡波氏肉瘤(KS),即AIDS病人最为常见的肿瘤。广泛的流行病学研究显示,KSHV的流行与KS相似并呈现明显的地域分布型。为调查KSHV在汉族普通人群中的感染情况,我们以KSHVORF65编码的小衣壳蛋白(smallcapsidprotein)为抗原,采用酶联免疫(ELISA)分析方法,对湖北地区560例汉族普通人群血清样品进行了KSHV抗体检测。在检测的560份血样中,KSHV抗体总阳性率为5.2%,其中,男性阳性率为5.7%,女性为4.5%。统计学分析显示,KSHV感染率在男女性别上无差异(P=0.542),但与年龄有一定的相关性:10岁以下儿童群体较之10岁以上人群KSHV感染率具有显著的统计学差异(P=0.006,OR=6.692,95%CI=1.710-26.198);60岁以上的老年人群KSHV感染率有上升趋势,但无统计学明显差异(P=0.052)。上述结果表明,KSHV在这一地区的流行与西方成年人群的感染率相似,但在儿童群体中的相对较高的感染率与一些非洲地区的接近。由此提示在该群体可能存在特殊的传播模式。

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒vGPCR具有巯基化酪氨酸的氨基端的表达和纯化(英文)

卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)编码的G-蛋白偶联受体(vGPCR)基因是一种癌基因,在KSHV致瘤过程中起着重要作用.前期工作揭示vGPCR的氨基端Y26和Y28两位酪氨酸的巯基化作用对其致瘤性至关重要.本研究将vGPCR的氨基端(1～49位氨基酸)以及其yydd突变体分别同鼠Fc片段有机连接并命名为wt-vG-N-mFc和yydd-vG-N-mFc.采用该两种重组质粒分别转染HEK293T细胞,重组融合蛋白分别从全细胞裂解液和细胞培养液中被纯化出来,并被考马斯亮蓝和印迹杂交鉴定.放射自显影表明wt-vG-N-mFc而非yydd-vG-N-mFc具有巯基化修饰作用.含有巯基化酪氨酸的vGPCR氨基端融合蛋白的成功表达和纯化为其将来在研究vGPCR的致瘤性和以vG-PCR为靶定目标的临床治疗中的应用打下了基础.

卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体的鉴定

目的:对已制备并经初筛的卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体进行特异性鉴定。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA),经3次克隆选择,筛选出能稳定分泌针对K8.1蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株共9株。采用Westernblot法评价9株杂交瘤细胞培养上清识别原核表达重组K8.1蛋白和原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞系BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白的能力。结果:筛选了9株能够稳定分泌抗K8.1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;Westernblot法显示,9株单抗均能特异性识别原核表达K8.1/GST融合蛋白和BCBL-1中KSHVK8.1包膜糖蛋白。结论:成功制备了KSHV包膜糖蛋白K8.1单克隆抗体。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒感染前列腺上皮细胞并激活Wnt信号通路的初探

目的:研究卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)是否能够感染前列腺非致瘤性上皮细胞系RWPE-1及前列腺癌细胞系PC-3,并初步探索其相关信号通路变化。方法:将12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤细胞系BC-3,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染RWPE-1及PC-3,观察前列腺细胞的细胞病变效应(CPE)。采用RT-PCR检测KSHV即刻基因ORF50 mRNA转录状况;进一步运用Western blot检查病毒裂解期产物病毒白细胞介素6(vIL-6)的蛋白表达水平;最后采用Western blot法检测被感染细胞胞浆和胞核中β-catenin表达水平。结果:PC-3细胞感染KSHV后未见明显CPE,但RT-PCR和Western blot均在预期位置检测到KSHV基因ORF50和vIL-6的mRNA及其编码的蛋白条带。RWPE-1细胞感染KSHV后可出现明显的CPE,感染后24h可以检测到vIL-6的表达。Wnt通路蛋白β-catenin在感染KSHV的RWPE-1细胞胞浆和胞核均呈上升趋势。结论:KSHV可以感染前列腺细胞系并有可能激活Wnt通路。

百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒DNA的套式PCR检测

目的了解百色市献血人群中卡波氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的流行状况。方法收集百色市部分无偿献血者肘静脉抗凝血474份,其中男259份,女215份,采用套式聚合酶链反应(n-PCR)方法对474例样本所提取的DNA进行KSHV特异性序列扩增,1.5%琼脂糖凝胶电泳,出现168bp条带为阳性结果。结果 474名献血者中9例阳性,阳性率1.90%;其中男性献血者中检出阳性者5例,阳性率为1.93%;女性献血者中检出4例,阳性率为1.86%。男女两组间阳性率采用χ2检验,差异无统计学意义(P>0.05)。结论百色市献血人群中存在KSHV的感染,不同性别献血者感染率差异无显著性。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒体外感染人牙龈成纤维细胞初探

目的:探索卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus,KSHV)体外感染人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)的途径和方法,为研究KSHV导致口腔卡波济肉瘤病变的机制提供依据。方法:用12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)刺激人原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL)细胞系的BC-3细胞,收集细胞上清(含KSHV病毒颗粒),感染HGF细胞。观察细胞病变效应(cytopatric effect,CPE),采用RT-PCR和Western blot分别检测HGF细胞内KSHV编码基因的转录情况和蛋白表达水平。结果:KSHV感染HGF细胞后可出现CPE;感染后采用RT-PCR可检测到不同时间点ORF26和ORF73基因的转录;感染后12 h可检测到vIL-6蛋白的表达。结论:KSHV可感染HGF细胞并建立潜伏感染,为进一步研究KSHV导致的口腔KS发病机制提供了较好的体外模型。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原编码基因的克隆及表达

目的:分离卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核心抗原(LANA)羧基端基因(ORF73C),并在大肠杆菌中克隆和表达。方法:设计一对PCR引物,在引物的5′端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点,提取稳定状态的BCBL-1细胞的总DNA作模板,通过PCR扩增KSHV ORF73C,PCR产物经双酶切后按正确的读码框克隆进原核表达质粒pGEX-6p-1中,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果:经核酸序列测定及分析,分离、克隆的ORF73C基因与基因数据库中登记的ORF73基因的羧基端的621bp的序列有99％同源性。经IPTG诱导的重组质粒转化菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳显示有大小约为46ku的融合蛋白表达。结论:初步表明ORF73C基因在大肠杆菌中获得正确表达。

HHV6感染激活卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的溶解性周期复制

运用细胞融合、细胞混合培养、条件培养基培养和病毒直接刺激等方法,研究人类疱疹病毒6型(HHV6)对卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)溶解性周期复制的影响。①将HHV6感染的JJhan细胞(T淋巴细胞系)与BCBL-1细胞(原发性渗出性淋巴瘤,PEL)进行细胞融合形成异核体细胞。②将HHV6感染的JJhan细胞与BCBL-1细胞进行混合培养。③收集HHV6感染的JJhan细胞培养上清液作为条件培养基进行灭活处理,以灭活前后的条件培养基培养BCBL-1细胞。进一步离心纯化HHV6病毒颗粒,并感染BCBL-1细胞,分别设紫外线和热灭活的HHV6病毒颗粒感染BCBL-1细胞为对照。提取上述的实验细胞总RNA,RT-PCR和/或实时定量(Real—time)PCR检测卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)次要衣壳蛋白编码基因ORF26mRNA转录。结果显示:①细胞融合后15h开始出现明显细胞病变,RT-PCR检测不同时间的实验组ORF26mRNA转录水平均明显高于对照组;Real—timePCR检测各时间ORF26mRNA转录水平是对照组的2.3倍以上;②细胞混合培养72h时,实验组ORF26mRNA转录水平是对照组的1.8倍;混合培养5天时,实验组KSHV裂解周期蛋白K8.1表达水平是对照组的2.46倍;③灭活前后的HHV6感染细胞培养上清液培养BCBL-1细胞96h时,ORF26mRNA转录水平分别是对照组的2.73倍和2.22倍;④灭活前后的HHV6均可增强BCBL-1细胞中KSHVORF26mRNA转录水平。提示:HHV6感染可激活KSHV的溶解性周期复制。