南海稀有放线菌的分离及其卤化酶基因分析

目的探究中国南海沉积物中放线菌的多样性并从中发现合成药物先导化合物的新菌源。方法采用6种选择性培养基分离24份来自南海沉积物样品中含有的放线菌。挑选不同培养特征的放线菌进行初步分类鉴别、16S rRNA基因序列系统进化分析及基于PCR的卤化酶基因筛选。结果共分离到900株放线菌,挑选的210株放线菌分别属于放线菌9个科,13个属,210株菌中有38株含有卤化酶的生物合成基因片段。结论海洋环境蕴含丰富的放线菌资源并具有产生天然的有活性卤化物的潜能。

烷基卤去卤化酶对芥子气的催化水解

本文通过密码子优化、高效表达并纯化出三种烷基卤去卤化酶DhaA、DmbA与LinB,评价了它们对芥子气的水解效率,分析并优化了酶促水解过程中需要调控的机制.通过实验,最终确定了活性成分为DhaA,缓冲剂为HEPES-NaOH,助溶剂为丙三醇的芥子气高效生物酶洗消体系,使用高效液相色谱质谱确定该体系的洗消产物为无毒硫二甘醇.酶活实验及对芥子气的消毒效果评价结果表明:该洗消体系对芥子气的最佳水解pH值为8.6,kcat/Km值为9.6s-1mmol·L-1,是国外同类水解酶的1.7倍,水解速率为自然水解速率的320倍,对10mg·mL-1芥子气的水解率从27.4%提高至93.2%,较好解决了高浓度芥子气高效水解脱毒问题.

参与抗生素生物合成的FADH_2依赖型卤化酶研究进展

从发现第一个天然卤化物到现在已有100多年了。在已发现的约4500个天然卤化物中有很多在医药等领域应用广泛,其中包括许多重要的抗生素。直到19世纪90年代中期,人们一直认为生物卤化反应主要由卤过氧化物酶负责催化。近期在许多关于抗生素生物合成基因簇的研究中发现FADH2依赖型卤化酶催化的卤化反应才是许多微生物及其它生物中的主要卤化机制。本文综述了参与抗生素生物合成的FADH2依赖型卤化酶的发现,催化机制及各种来源的该类卤化酶研究进展,并介绍了该类酶在组合生物合成及寻找天然卤化物等方面的应用。

海洋链霉菌Streptomyces sp.B-17卤化酶基因的克隆及生物信息学分析

海洋放线菌是生理活性物质重要的产生菌,而海洋放线菌产生的卤化酶可催化生理活性物质的卤化,极大提高了其抑菌和抗癌活性。从大连海域分离出1株链霉菌Streptomyces sp.B-17,从其基因组DNA中扩增一524 bp的基因片段,经与pMD-19T载体连接,转化大肠埃希菌JM109感受态细胞,重组质粒经鉴定证明正向插入到pMD-19T载体。生物信息学分析表明该序列与Actinocorallia herbida DSM 44252的2个依赖FADH2卤化酶基因的同源性为88%,拟编码氨基酸与色氨酸卤化酶(CP001848)的相似性也达到74%,证明所克隆的基因片段为卤化酶基因片段,为后续的基因功能分析及表达奠定了基础。

微生物卤化酶及其应用研究进展

由于卤素原子具有强大的电负性,它的存在可以改变化合物的物理化学性质和生物活性。尽管我们可以通过化学反应合成卤化物,但能量消耗大,易对环境造成污染。许多天然化合物含有卤素原子,自然界演化出多种卤化酶来负责这些化合物的卤化。本文综述了目前发现的各种卤化酶及其特征以及催化机理,简介了如何通过人工改造拓宽卤化酶的催化底物和提高其热稳定性两方面的研究进展,为进一步促进卤化酶在工业催化方面的应用提供理论依据。

星海链霉菌卤化酶重组蛋白在大肠杆菌中可溶表达

大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是表达异源蛋白的良好宿主,但常遇到蛋白表达产物不可溶的困难.在对来自星海链霉菌的卤化酶基因sinH进行大肠杆菌异源表达时,为克服蛋白表达产物可溶性低的问题,探讨了不同载体对蛋白可溶表达的影响.利用pET28a进行SinH表达时不能得到可溶的目标蛋白;使用含有泛素标签及内含肽的载体pHUIE实现了卤化酶蛋白SinH的可溶表达,但纯化后纯度不高;利用带有链霉菌分子伴侣蛋白基因的载体pET28a-SinH与pETcoco-pL1SL2在E.coli BL21(DE3)中共表达,在30℃,0.1mmol/L IPTG诱导条件下表达4h,成功获得大量可溶蛋白,使用亲和层析(Ni-NTA)纯化,获得了较纯的目标蛋白SinH,上述研究结果为在大肠杆菌中进行其他链霉菌蛋白的可溶表达提供了参考.

FADH_2-依赖型卤化酶阳性放线菌1076的筛选、分类鉴定及其代谢产物的结构研究

目的筛选FADH2-卤化酶阳性菌株发现天然卤化物。方法设计新的简并引物对200株放线菌基因组卤化酶基因扩增以筛选阳性菌株,并进行比对分析;对阳性菌株进行分类鉴定,对其代谢产物进行HPLC-MS分析。结果筛选得到到51株阳性菌,其中一株与恩拉霉素的同源性为99%。对该编号为1076的菌株进行的分类鉴定结果,确定为Streptomyces macrosporeus。对其代谢产物进行的HPLC-MS分析显示,其代谢产物与恩拉霉素同质。结论卤化酶阳性菌株1076属于S.macrosporeus的一个菌株,是新的恩拉霉素产生菌。

新型核苷碱基卤化酶AcmX的原核表达和结晶

在链霉菌中发现了一类能对核苷碱基进行特异位点卤化修饰的新型卤化酶,通过表达纯化新型卤化酶的活性蛋白、制备蛋白晶体,可对其进行蛋白结构的解析,揭示生物催化卤化反应的机理.在大肠杆菌直接原核表达AcmX,只能得到没有活性的AcmX的蛋白包涵体.借助分子伴侣的表达质粒pGro7,构建AcmX、分子伴侣的共表达系统,发现在30℃,0.5mM IPTG和0.3g/L阿拉伯糖诱导表达3h,可避免目标蛋白AcmX包涵体的形成,并得到足够表达量的目标蛋白,通过高分辨率的分子筛凝胶层析步骤,可去除混入AcmX样品的分子伴侣蛋白GroEL,得到可以用于结晶实验的高均一性的活性AcmX蛋白样品.

色氨酸卤化酶研究进展

能催化卤代反应的卤化酶,因其具有高效、选择性好、反应条件温和的特点受到广泛关注。其中色氨酸卤化酶是研究最多的一类酶,它的特点是可以有选择性地卤化色氨酸,主要包括氯化和溴化。而卤代化合物具有多种生物活性,在医药、化工等领域有着广泛的应用。本文主要介绍了色氨酸卤化酶的来源和种类,酶学性质及其异源表达的研究现状;重点阐述了其结构和功能之间的相互关系及催化机理;并对色氨酸卤化酶的应用以及未来发展方向进行了展望,以期为色氨酸卤化酶的开发应用提供参考。

黄素依赖型卤化酶的研究进展及应用

卤化物在医药化工领域有着不可替代的地位,然而传统的有机化学卤代反应因其严苛的反应条件和高毒性而限制了推广应用。随着生物化学中酶反应的发展,卤代酶以高效率条件温和的特点被逐渐重视起来。在已发现的各类不同种类以及各样作用机理的卤代酶中,黄素依赖型卤代酶(flavin-dependent halogenases)具有良好的底物特异性以及稳定的催化位点选择性。而通过对蛋白结构的研究以及突变改进酶的特性,这类卤代酶被证明可以用于工业生产以及药物开发。尽管目前对于黄素依赖型的研究正处于起步阶段,但其广泛的分布性以及稳定可控的特性给未来的应用带来光明的前景。

不同生境放线菌的卤化酶基因分析及其对卤代产物筛选的意义

【目的】在基因水平上分析并比较陆地来源与海洋来源的放线菌产生卤化代谢产物的潜力。【方法】基于依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的卤化酶基因筛选,从经过表型去重复的70株陆地来源和71株海洋来源的放线菌中,通过PCR筛选获得卤化酶基因片段,并进行测序鉴定;通过卤化酶氨基酸序列的系统发育分析,比较不同来源放线菌的卤化酶序列,以及海洋链霉菌和小单孢菌的卤化酶序列。另外,对卤化酶阳性菌株进行了聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因的检测。【结果】本研究中36.6%的海洋放线菌具有卤化酶基因,其阳性率远高于本研究所涉及的陆地放线菌(14.3%);其中海洋链霉菌的卤化酶基因阳性率高达69.0%,而海洋小单孢菌的卤化酶阳性率仅为14.3%。86.1%的卤化酶阳性菌株具有聚酮合酶和/或非核糖体多肽合成酶基因。本研究获得的海洋来源的卤化酶序列与已知的卤化酶序列存在明显差异,在进化树上形成几个新的分支;其中链霉菌间的卤化酶序列相似性较高,而小单孢菌间的卤化酶序列差异较大。【结论】海洋来源的放线菌,尤其是海洋链霉菌,可作为未来获得新卤化活性物质的一类重要微生物资源。

黄素依赖型卤化酶及其应用研究进展

卤化物是农业、制药业和化学工业的重要原料,主要以化学法合成,该法具有环境不友好和合成条件苛刻等劣势。天然卤化物生物合成途径的关键酶为卤化酶,包括卤过氧化物酶(haloperoxidase,HPO)、α-酮戊二酸依赖型卤化酶(α-ketoglutarate dependent halogenase,KG-Hal)、S-腺苷甲硫氨酸依赖型卤化酶(S-adenosylmethionine-dependent halogenase)和黄素依赖型卤化酶(flavin-dependent halogenase,FDH)。其中,黄素依赖型卤化酶因其分布广泛、具有底物特异性和卤化位点选择性,是最具开发潜力的卤化酶。因此,本文对黄素依赖型卤化酶的结构、类型、催化机制及其应用研究进展进行综述,对利用基因分析和基因筛选方法寻找新型黄素依赖型卤化酶进行了展望。本综述有助于拓展黄素依赖型卤化酶的类型及其催化机制的知识,推动黄素依赖型卤化酶及其酶工程的研究,为新型卤化物的合成提供技术思路。

酶催化卤化和去卤化反应

通过研究微生物降解卤素化合物发现了不同种类的去卤化酶,这些酶可以在好氧或厌氧条件下通过不同的作用机理脱去卤原子催化降解卤素化合物。到目前,通过生物法得到将近4000多种卤素化合物,早期仅分离并获得了催化卤化反应的卤过氧化物酶,近来,在研究细菌卤化代谢物的生物合成时发现了以FADH2为辅基的卤化酶。这种新型的卤化酶在卤化代谢物的生物合成中起催化作用。

北极海洋链霉菌604F的卤化酶基因克隆及特征

【目的】本研究旨在克隆来自北极海洋、具有合成卤化物潜力的链霉菌(Streptomyces sp.)604F中的一个卤化酶基因,为后续克隆卤化物合成基因簇、分离鉴定卤化物提供指导。【方法】利用琼脂块法初步测试抗菌活性,借助液相色谱-飞行时间串联质谱技术(LC-Tof MS)初步寻找Streptomyces sp.604F发酵粗提液中的卤化物,并以简并PCR扩增合成次级代谢产物的指示基因(I型、II型聚酮合酶及非核糖体多肽合成酶编码基因);根据依赖黄素腺嘌呤二核苷酸的卤化酶基因保守区设计的简并引物,扩增基因片段并测序分析;采用高效热不对称交错PCR(hiTAIL-PCR)技术扩增卤化酶基因全长。【结果】Streptomyces sp.604F具有较强的抗白色念珠菌活性,其基因组同时含有编码I型聚酮合酶、II型聚酮合酶和非核糖体多肽合成酶基因,以及卤化酶基因;通过染色体步移克隆该卤化酶基因全长,共1443 bp,编码一个新的非色氨酸卤化酶,在合成已知卤化物的卤化酶数据库中,与其同源关系最近的为一类参与合成糖肽类次级代谢产物的卤化酶。【结论】Streptomyces sp.604F具有新的非色氨酸卤化酶,且推测参与糖肽类化合物的卤化修饰,为后续寻找目的卤化物提供了指导,也为研究该合成基因簇奠定基础。

黄素依赖型卤化酶的结构特点及工程改造

卤化物是通过卤化酶催化卤族元素在有机化合物上特定位置发生取代形成的一类化合物,具有独特的生理生化作用。黄素依赖型卤化酶具有良好的区域选择性,虽然有相似的黄素分子的结合位点,但在底物结合方面略有不同,对其结构和合成途径及结合蛋白质工程的随机诱变和定向改造的研究在工业应用中至关重要。讨论了具有高区域选择性的黄素依赖型卤化酶的结构特点及工程改造,以及经过工程改造后黄素依赖型卤化酶在工业生产中的应用。

基于序列筛选发掘宏基因组文库中的新颖卤化酶基因

绝大部分微生物的不可培养性使微生物的开发利用受到了限制,而宏基因组学策略为研究土壤中的不可培养微生物提供了途径.天然卤化物具有抗菌活性和抗肿瘤活性等生物活性,卤化酶在催化化合物的卤化过程中,对化合物活性产生重要影响,而以卤化酶基因为探针,可以发现与之偶联的天然生物合成基因簇,为卤化物的发现提供基础.利用卤化酶基因序列的保守区域设计简并引物,筛选土壤宏基因组文库获得卤化酶阳性克隆,并对获得的卤化酶基因间的进化及其与天然产物合成的关系进行分析.结果显示:通过同源序列筛选获得了65个卤化酶阳性克隆,序列同源分析表明约85%的阳性克隆中的卤化酶基因序列与已知卤化酶的相似性低,所获卤化酶基因具有较好的新颖性和多样性.而对所获克隆中生物合成相关基因的分析表明其中一个克隆中同时存在聚酮合酶基因与卤化酶基因,其可能与卤代I型聚酮合成相关.本研究基于序列筛选的方法,从宏基因组文库中发现了新的卤化酶基因和聚酮合酶基因,为进一步发现新颖的天然卤化物生物合成基因簇及天然卤化物奠定了基础.

蜚蠊肠道放线菌的卤化酶基因检测及初步分析

[目的]对159株蜚蠊肠道内生放线菌的卤化酶等相关基因进行检测和初步分析。[方法]活化蜚蠊肠道内生放线菌,制备各菌株基因组DNA,根据依赖黄素腺嘌呤二核苷酸FADH2的卤化酶基因保守区设计简并引物,通过PCR扩增卤化酶基因片段,TA克隆后进行测序鉴定。在此基础上,对卤化酶阳性菌株进行聚酮合酶PKSⅠ和非核糖体多肽合成酶NRPS等2个次级代谢产物生物合成主要基因进行检测。[结果]159株蜚蠊肠道放线菌有84株含有卤化酶基因,占比52.83%;卤化酶基因阳性放线菌中71株含有PKSⅠ基因,70株含有NRPS,占比分别为84.52%、83.33%。[结论]蜚蠊肠道含有较丰富的卤化酶基因阳性放线菌,可作为未来分离卤化活性物质的微生物资源。

芥子气酶促水解体系的控释方法研究

针对烷基卤去卤化酶水解芥子气过程中,缓冲体系仍然无法避免生物酶失活的问题,提出以天然生物材料壳聚糖为包覆壳材,三羟甲基氨基甲烷为芯材制备控释材料,对芥子气酶促体系进行p H值调控。通过研究喷雾干燥法和流化床法2种工艺方法,使用红外、扫描电镜等表征手段,确定控释材料的包覆形态及最佳包覆工艺。利用酶活试验结合p H值监测确定了控释材料的最佳加入量。研究结果表明,最佳制备方法为喷雾干燥法,将0.004 4 mg/m L的壳聚糖控释材料加入芥子气酶促体系中,酶活力提高从1.35 U/m L提高至2.47U/m L,控释材料有效提高了烷基卤去卤化酶对芥子气水解催化活性。

生物降解有机卤化物

近来,从一些可利用卤化底物的细菌中分离出了新的去卤化酶。利用X衍射分析和序列分析已揭示出水解去卤化酶的分子机制。另外,基因和生物化学研究还发现,还原去卤化酶是胞外含咕啉化合物的铁硫蛋白;序列分析和突变研究表明,这些去卤化酶相对那些可转化非卤化底物的酶是同源的。

来源卤化二型聚酮类生物合成基因簇的两种关键功能基因鉴定与表达

为催化卤化产物,挖掘具有生物活性的新卤化物提供新的方法途径,拟构建卤化酶原核表达载体催化天然卤化物的卤化过程。对链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2基因组中一个II型PKS类产物zunyimycin生物合成基因簇进行系列分析,针对其中的后修饰酶卤化酶基因和单加氧酶基因进行原核表达纯化。通过分子生物学手段成功构建卤化酶基因(65 kD)和单加氧酶基因(37 kD)的原核表达载体,并对其进行鉴定。卤化酶和单加氧酶在催化化合物的卤化过程中,会产生疑似新卤化产物。