病毒卫星RNA及其致弱病毒的机理──我国病毒学基础研究进展之一例

病毒卫星ＲＮＡ及其致弱病毒的机理──我国病毒学基础研究进展之一例田波（中国科学院微生物所分子病毒与生物工程研究室，北京１０００８０）１卫星ＲＮＡ的本质和生物学地位病毒卫星ＲＮＡ是美国ＫａＰｅｒ等于１９７６年在黄瓜花叶病毒中首先发现的［１］，它是伴随病...

甜(辣)椒导入CMV卫星RNA互补DNA的植株再生

甜(辣)椒(Capsicum annuum L.)是我国主要蔬菜之一,黄瓜花叶病毒(简称CMV)和烟草花叶病毒(简称TMV)常造成甜(辣)椒的严重危害。经过多年的育种实践,人们已经有了较好的抗TMV育种材料。而对CMV,目前还没有可利用的自然抗源和有效的防治措施。国内外在利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行甜(辣)椒的转化研究已有报道。W.Liu等(1990)获得了抗卡那霉素的芽组织并有GUS基因表达;王玉文等(1991)检测到GUS基因在甜椒子叶上的瞬间表达。本试验试图利用农杆菌导入抗CMV基因(CMV卫星RNA互补DNA),以提高甜(辣)椒的抗CMV能力。

黄瓜花叶病毒萝卜分离株卫星RNA的克隆及其与12个卫星RNA核苷酸序列的比较

对一株分离自萝卜 ( Raphanus sativus)的黄瓜花叶病毒 ( CMV)卫星 RNA( Rs)进行了 c DNA克隆与序列确定 ,并与 12个已知的卫星 RNA序列进行了比较 .结果表明 :卫星 RNA Rs的大小为 368nt;该卫星 RNA所比较的 13个卫星 RNA的大小分布为 334～ 4 0 5nt,可分为 3个组和 4个亚组 ;CMV卫星 RNA的序列同源性和分组与卫星 RNA的大小并无直接联系 .卫星 RNA序列之间的连续缺失和插入均集中在 90～ 2 55nt间几个邻近的区域 .在卫星 RNA二级结构中的非配对区序列、卫星 RNA的 5'端近 80个碱基和 3'端近 4 5个碱基相当保守 .由此推测 CMV卫星 RNA的理论长度可达 4 4 6nt.序列结构的比较显示 ,CMV卫星 RNA具有作为外源基因载体的潜力 .

系统侵染寄主中黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的动态变化

以3 2 P标记的黄瓜花叶病毒 (CMV)RNA3cDNA片段和卫星RNA全长cDNA作为探针 ,定量测定CMV基因组RNA和卫星RNA的含量变化 ,结果显示 :二者均具有明显的寄主效应和时间效应 .在 16～ 2 0℃条件下 ,接种不携带卫星RNA的分离物CMV R3,15天、 30天和 75天时 ,CMV基因组RNA负荷量呈显著下降的趋势 .在第 15天 ,RNA3的负荷量以烟草 >心叶烟 >克里夫兰烟 >番茄的顺序表现为不同寄主的显著性差异 .相同条件下接种携带高拷贝卫星RNA的分离物CMV RS ,在 5天和 15天之间基因组RNA和卫星RNA负荷量均呈现上升的趋势 ,同时测得其基因组RNA和卫星的负荷量具有相似的寄主效应和时间效应 ,但程度不同 .第 15天时 ,二者负荷量以烟草 >心叶烟 >番茄的顺序表现寄主效应的显著性差异 .在 18～ 2 1℃条件下 ,接种携带坏死卫星RNA的CMV强毒株HC4 ,第 5天、第 10天和第 15天时 ,基因组RNA和卫星RNA的负荷量均以番茄>心叶烟 >烟草的顺序表现出显著性差异 ,并表现出明显的时间效应 .

黄瓜花叶病毒致弱卫星RNA对辅助病毒含量的影响

为研究黄瓜花叶病毒 (CMV)弱病毒株的基因组RNA和卫星RNA的含量变化 ,将一个卫星RNA介导的CMV弱病毒株NDM 1与CMV强毒株在 4种寄主系统上进行对照实验 .采用RNA点杂交方法 ,检测从早期接种病毒到大田释放阶段 (病毒接种后 5到 4 0天 ) ,寄主植物叶组织中的基因组RNA和卫星RNA的相对含量变化 .结果显示 :弱病毒株NDM 1基因组RNA和卫星RNA负荷量具有寄主效应和时间效应 ,趋势一致但程度不同 .它们在番茄上的变化规律不同于其他寄主而且病毒的致弱效果最明显 :在接种后的 5～ 10天 (生产上接种育苗的保护期 ) ,基因组RNA和卫星RNA相对含量上升 ,到 4 0天 (大田释放期 )时回落至最低 .比较NDM 1于不同时间在各寄主上的卫星RNA和基因组RNA的相对比值 :在 4 0天时 ,寄主番茄上的相对比值达 15 8,与在其他寄主上和其他时间段比较均有显著差异 ,即此时卫星RNA达到含量优势 .说明弱病毒NDM 1在番茄上的致弱机制为 :卫星RNA的大量复制对CMV基因组RNA产生抑制作用 .

新疆石河子南瓜和加工番茄CMV卫星RNA与RNA3序列分析

为探究石河子地区侵染南瓜和加工番茄的CMV卫星RNA及基因组RNA3的分子变异及株系分化,从石河子蔬菜研究所采集南瓜和加工番茄样品并提取dsRNA,利用RT-PCR方法克隆5个CMV卫星RNA序列和2个CMV RNA3序列,南瓜样品卫星RNA及RNA3分别命名为N-sate和N-R322,片段大小分别为335nt和2 214nt;加工番茄样品卫星RNA及RNA3分别命名为To-9-sate、S18-1、S9、S18-2和To-9-R322,片段大小分别为381nt、396nt、334nt、334nt和2 216nt。卫星RNA序列分析结果显示,卫星RNA的序列差异与地域有一定的相关性,与寄主类别无关。同时这5个卫星RNA序列都不含有CMVYSAT所具有的黄化区域。N-R322和To-9-R322序列分析结果显示,二者均属于CMV亚组ⅠB,且CMV分离物有一定的地域相关性,没有明显寄主相关性。

侵染上海番茄的黄瓜花叶病毒及其卫星RNA的^(32)P分子标记杂交检测及分子鉴定

2004和2005年夏季,在上海郊区露天栽培的番茄地出现典型的病毒病危害,并造成严重的产量损失。分别以32P标记的CMV基因组RNA3部分序列和卫星RNA的cDNA探针对自然感病的番茄叶组织和提纯的病毒粒子中提取的总RNA进行杂交检测,确定以上植物组织和病毒粒子中均具有CMV及卫星RNA。dsRNA分析确定自然感病叶组织中具有典型黄瓜花叶病毒(CMV)基因及其卫星RNA条带。以常规引物对感病植物的总RNA进行RT-PCR扩增,获得CMV RNA3全长克隆,经测序显示该RNA3序列属于CMV亚组Ⅱ;通过在卫星dsRNA两端分别加上15nt的单链DNA接头,以接头互补序列为引物进行扩增获得一个383nt的卫星RNA的全长序列。同源性分析结果显示其与已报道的CMV卫星RNA同源性为72.6%~99.5%,但其3′末端存在多个碱基的突变。根据同位素杂交检测及分子鉴定,CMV及其卫星RNA变异类型在上海自然感病番茄上发生和普遍存在,可能对病害流行和新的症状出现产生影响。

添加卫星RNA对黄瓜花叶病毒寄主反应及其在系统寄主中含量的影响

为了解卫星RNA(satRNA)对辅助病毒在系统寄主中的直接影响,将1株黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)的卫星RNA(satRNA)sat-Yi与本身不携带卫星RNA的CMV分离物CNa在体外进行假重组,获得了人工构建的假重组毒株CMV-NY。通过寄主反应测定、双链RNA分析和全序列分析,显示satYi与CMV-CNa基因组RNA能够稳定共存,经过反复转接也没有发现卫星RNA的序列突变。通过测定CMV-CNa和NY这2个病毒株的寄主反应,发现satRNA-Yi的存在明显延迟了CNa在所有供试寄主中的发病时间,而且明显减弱了其在多数供试寄主上的症状表现,其中在葫芦科植物上表现出减轻症状的效果最明显;用一种新建的核酸玻片杂交方法,定量测定寄主植物中CMV基因组CP基因及卫星RNA的相对含量变化,结果显示:26℃条件下,在接种5、10、15、20、25和30d的心叶烟中,2个毒株的CP基因含量都呈下降趋势,在相应的时间内,NY-CP基因在同一寄主中的含量均低于CNa-CP基因的含量;接种10d,NY与CNa的寄主适应性没有显著差异,二者基因组CP基因在6种寄主植物中的相对含量均为番茄>假酸浆>心叶烟>西葫芦>南瓜>曼陀罗。由此得出以下结论:sat-Yi降低了CMV CP基因在寄主中的含量,且随着接种时间的增加,卫星RNA的影响作用越明显;sat-Yi不改变CMV基因组RNA的寄主适应性,但是通过降低CP基因含量改变其症状特征。

含卫星RNA的黄瓜花叶病毒弱株系的分离鉴定及在病毒病防治上的应用

从豌豆上分离获得黄瓜花叶病毒分离物ＣＭＶＰ１，摩擦接种９科２９种植物，ＣＭＶＰｌ在大多数植物上症状很轻或无任何症状，提纯的病毒颗粒为球形，直径约２８ｎｍ，病毒衣壳蛋白亚基分子量约２７．５ｋＤ，所含核酸有五个组份，即ＣＭＶＰ１含有卫星ＲＮＡ。ＣＭＶＰ１接种三生烟后８－１２天内呈轻花叶，此时组织中病毒含量最高，随后症状消失，去除卫星ＲＮＡ能加重ＣＭＶＰ１在番茄上的症状，因而是卫星ＲＮＡ减轻了ＣＭＶＰｌ的病状。当ＣＭＶＰ１保护接种番茄后攻强毒，番茄发病率低，病情轻，保护率达９０％以上，并有一定的刺激生长作用，还能提早开花４天，植株结果数增多，成熟果实的颜色、形态、品质和重量均正常。ＣＭＶＰ１对烟草亦具有很好的保护效果。保护接种的植株能明显减少强毒株侵染，可减少９０％以上。

卫星RNA SatC382对辅助病毒的影响

通过体外转录将黄瓜花叶病毒(CMV)卫星RNASatC382与不带卫星的黄瓜花叶病毒CNa株系进行假重组,获取带卫星的CMV重组株(CNa -SatC382)。经dsRNA提取及RT PCR检测,证实CNa和SatC382在假重组株中能稳定共存。测定CNa和CNa -SatC382的14种寄主生物学反应,并统计两者接种昆诺藜、假酸浆、心叶烟、西葫芦7、14、21、28d的病情指数,结果显示:带卫星和不带卫星的CMV在各供试寄主上表现的症状差别不明显,病情指数也无显著差异。由此推测卫星RNASatC382没有改变辅助病毒CMV -CNa株系对寄主症状的影响。

卫星RNA在调节植物病毒病害症状中的作用

根据近２０ 年来的有关研究报道，对卫星 Ｒ Ｎ Ａ 在植物病毒病害症状中的调节作用进行了综述，内容主要包括卫星 Ｒ Ｎ Ａ 调节病毒病害症状的类型、调节专一性。

两株黄瓜花叶病毒卫星RNA的竞争与共存研究

通过体外转录方法 ,将大小分别为 36 9nt和 385nt的 2个黄瓜花叶病毒 (Cucumbermosaicvirus,CMV)的卫星RNAYi和Yns共同与不含卫星的辅助病毒株CMV_CNa进行假重组 ,接种CMV系统寄主心叶烟。结果表明 :在接种5d的接种叶上同时检测到卫星RNA_Yi和卫星RNA_Yns;在系统叶上 ,接种 5d和 10d亦可同时检测到 2株卫星 ;但接种 15d ,在系统叶组织中只检测到卫星RNA_Yi。再将接种 5d的接种叶扩大接种到几种不同的指示植物后 ,经dsRNA抽提 ,也只获得 1条与卫星RNA_Yi大小相符的条带。通过假重组病毒株中分别获得卫星RNA并测序 ,确定2个卫星RNA的序列没有变化。卫星RNA_Yns和Yi在辅助病毒CMV_CNa作用下 ,表现出明显的竞争性 ,它们在辅助病毒中不能形成稳定的共存关系。

香蕉花叶病病原病毒及其卫星RNA的研究

进一步证明，我国华南地区香蕉花叶病的病原病毒种类主要是由黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）引起的。在广西部分地区发现有烟草花叶病毒（ＴＭＶ）的新株系感染香蕉。分离得到ＣＭＶ的卫星ＲＮＡ。

卫星RNA研究新进展:结构与功能表达

植物病毒卫星通常是指那些如果没有特定辅助病毒的帮助就不能复制,而它本身对于辅助病毒的复制是不必需的,且与辅助病毒的基因组无序列同源性的一类RNA分子。到目前为止,已报道有六组共26种植物病毒带有卫星。这些植物病毒卫星有的具有编码自身外壳蛋白的遗传信息,称卫星病毒;有的无此编码功能称为病毒卫星RNA。病毒卫星RNA在其发现的早期,其生物学功能尚不为人重视。然而,七十年代早期,在法国阿尔萨斯爆发的由黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Virus,CMV)侵染引起的番茄作物坏死病被确定与CMV卫星RNA有关,至此。

黄瓜花叶病毒卫星RNA生防制剂防治辣椒病毒病的研究

在宁夏银川地区4个主要蔬菜基地采集表现病毒病症状的辣椒标样68个，采用鉴别寄主的生物学反应和双抗夹心ELISA法鉴定，结果表明引起银川地区辣椒病毒病的主要病原是黄瓜花叶病毒（CMV）．用黄瓜花叶病毒的卫星RNA生防制剂S52免疫辣椒，能防治辣椒由CMV引起的病毒病．用S52免疫接种辣椒进行田间对比试验，免疫接种50d的防效达71．2％～84．2％，免疫接种80d的防效达55．9％～70．2％．

黄瓜花叶病毒卫星RNA与马铃薯纺锤形块茎类病毒间序列同源性与碱基配对

黄瓜花叶病毒卫星ＲＮＡ与马铃薯纺锤形块茎类病毒间序列同源性与碱基配对田波（中国科学院微生物研究所，北京１０００８０）Ｇ．ＳｔｅｇｅｒＤ．Ｒｉｅｓｎｅｒ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｆｕｒＰｈｙｓｉｋａｌｉｓｃｈｅＢｉｏｌｏｇｉｅ，ＵｎｉｖｒｓｉｔａｔＤｕｓｓｅｌ...

绒毛烟斑驳病毒卫星RNA的一种突变体的初步研究

用电泳检测 VTMoV88感染绒毛烟后病毒特异性核酸组份,发现核酸的小分子 RNA(卫星 RNA)组成发生变化。提纯的病毒通过电镜观察及血清学鉴定并与 VTMoV 加以比较,证明两者在颗粒形态、大小及血清学关系上一致。以克隆的 VTMoV-RNA3 cDNA 片断为探针检测 VTMoV 与 VTMoV88卫星 RNA 分子之间的核苷酸序列同源性,结果显示出两种毒源的卫星 RNA 具有高度同源性。据此,推测 VTMoV88可能是卫星 RNA 发生变异的突变体,并对 VTMoV88卫星 RNA 突变体形成机制进行了初步探讨。

黄瓜花叶病毒卫星RNA XJs1侵染性cDNA克隆构建及其生物学功能初步研究

利用RT_PCR的方法,获得了黄瓜花叶病毒卫星RNA XJs1的全长侵染性cDNA克隆pMSC20。序列分析显示,XJs1全长384nt(GenBank登录号:DQ070748),比较XJs1与具有代表性的CMV卫星RNA的序列结构表明,在XJs1核苷酸序列的325nt^350nt间,具有典型的坏死型卫星RNA保守序列。通过体外转录,将XJs1与不含卫星RNA的辅助病毒分离物CMV_AH组合接种普通烟和心叶烟并进行检测。初步研究结果表明,XJs1为一致弱卫星RNA。

黄瓜花叶病毒弱株系CMVP_1卫星RNA的cDNA合成、克隆及序列分析

黄瓜花叶病毒弱株系ＣＭＶＰ_１卫星ＲＮＡ的ｃＤＮＡ合成、克隆及序列分析周雪平，刘勇，薛朝阳，李德葆（浙江农业大学生物技术研究所，杭州３１００２９）ＣｌｎｉｎｇａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓａｔｅｌｌｉｔｅＲＮＡｇｅｎｅｏｆｃｕｃｕｍｂｅ?..

黄瓜花叶病毒卫星RNA T1株系的功能研究

采用RT-PCR在(cucumber mosaic virus,CMV)侵染番茄(Lycopersicon esculentum)中获得一卫星RNA(T1sat,登陆号DQ785472)。以CMV-Fny作为T1sat辅助病毒,CMV-Fny和CMV-Fny+T1sat分别接种烟草(Nicotiana tabacum)和番茄2种寄主植物。接种3 d后,RT-PCR检测寄主系统叶中卫星RNA发现,T1sat均存在于烟草和番茄中,处理寄主的总RNA电泳分析结果也表明:以CMV-Fny为辅助病毒,T1sat在烟草和番茄中均能高含量积累。其中T1sat减轻CMV-Fny在烟草中症状,而CMV-Fny与T1sat混和接种则引起番茄产生坏死症状。接种7 d和14 d后,采用Realtime RT-PCR分析T1sat对这2种寄主中CMV-Fny各基因组影响的结果显示,T1sat均减少烟草和番茄中病毒基因组的含量,但在番茄中T1sat的抑制效应比在烟草中明显。本研究结果提示:T1sat分别减轻和加重CMV-Fny在烟草和番茄中的病毒症状反应,且T1sat均降低CMV-Fny在烟草和番茄中的基因组含量。