父源印记基因H19印记控制区域DNA甲基化与少、弱精子症相关性分析

目的:研究印记基因H19印记控制区域的DNA甲基化程度与男性少、弱精子症的相关性。方法:通过染色体核型分析和Y染色体微缺失检测排除染色体因素干扰,进一步借助精液常规参数、伊红染色以及精子形态等指标,筛选出18例单一因素少精子症患者(浓度<15×106/ml,其余指标均正常)和20例单一因素弱精子症患者(前向运动精子百分率<32%,其余指标均正常)用于DNA甲基化检测;提取精子样本全基因组DNA,进行亚硫酸氢盐处理、PCR扩增目的基因片段并测序;通过BIQ Analyzer软件对测序结果进行质控和DNA甲基化程度分析。20例正常生育男性精液标本作为对照组。结果:与对照组甲基化丢失率[(0.30±0.06)%]相比,少精子症患者的H19印记控制区域的DNA甲基化丢失程度显著增高[(9.19±2.45)%],尤其当精子浓度<3×106/ml时,差异达到极显著水平(P<0.01)。在弱精子症患者中H19印记控制区域的DNA甲基化丢失程度[(0.30±0.07)%]和模式均与对照组无显著差异(P=0.62)。进一步重点分析了CTCF6位点的DNA甲基化状态,少精子症患者的DNA甲基化丢失程度[(2.67±0.75)%]显著高于对照组[(0.05±0.03)%]和弱精子症组[(0.03±0.02)%],而后两者之间无显著差异(P=0.35)。结论:H19印记控制区域的DNA甲基化程度的降低与少精子症密切相关,且降低程度与精子浓度呈显著负相关,而与精子活力无关。

脐血胰岛素样生长因子-2和印记基因H19与胎儿生长受限的关系

目的探讨脐血胰岛素样生长因子-2(IGF-2)和H19印记状态与胎儿生长受限(FGR)的关系。方法采用放射免疫法测定42例FGR孕妇(研究组)和晚期正常妊娠妇女30例(对照组)脐血中IGF-2水平,同时采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术,检测胎盘组织中H19基因印记状态。结果①研究组脐血IGF-2水平为(1.52±0.20)μg/L,明显低于对照组的(1.97±0.21)μg/L(P<0.05)。②研究组中杂合子20例,其中9例双等位基因表达;对照组中杂合子14例,均为单等位基因表达;研究组H19基因印记丢失明显高于对照组(P<0.05)。③研究组H19双等位基因表达的病例脐血IGF-2水平均明显低于H19杂合性丢失和H19单等位基因表达病例(P<0.05);H19杂合性丢失和H19单等位基因表达病例脐血IGF-2水平无显著性差异。结论妊娠晚期IGF-2减低是导致FGR发生的原因之一;H19基因印记丢失下调IGF-2基因间接影响胎儿生长发育。

MSRE-qPCR法检测少弱精子症患者父源印记基因H19上游区域甲基化水平

目的建立精子中父源印记基因H19上游区域MSRE-qPCR检测方法,并分析男性少弱精子症患者精子父源印记基因H19上游区域甲基化水平。方法收集20例正常精液样本,同时筛选30例少弱精子症患者精液样本,应用甲基化敏感性限制性内切酶法并结合定量PCR对所有样本父源印记基因H19上游区域甲基化水平进行分析。结果正常精液样本父源印记基因H19上游区域平均甲基化率为(99.8±2.72)%,高于少弱精子症患者精液样本的(82.4±15.30)%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 MSRE-qPCR法可用于父源印记基因H19上游区域甲基化水平的检测,少弱精子症者精液样本父源印记基因H19上游区域甲基化水平显著低于正常人。

印记基因H19在不同质量精子和胚胎中的甲基化状态

目的对印记基因H19在三种不同质量的精子中的甲基化状态以及精卵结合后形成胚胎的甲基化状态进行比较,初步探索精子甲基化状态与受精后胚胎甲基化状态的关系.方法收集在云南省第一人民医院生殖医学科行IVF-ET治疗中废弃的精子91份和D3期低质量胚胎171份,依据WHO第5版根据精子参数将精子样本分为3组,分别分析3组的精子及受精后胚胎H19的甲基化状态.结果 B组在精子中和胚胎中H19甲基化状态异常比例显著高于另外2组(P<0.05).结论印记基因H19甲基化状态异常主要集中在异常参数精子组中,提示其异常状态与精子质量降低有关;通过IVF、ICSI受精后的胚胎都出现同等比例的异常状态,没有显著差异;异常精子的胚胎未出现异常,这可能与胚胎自身的自我修复功能有关;而个别正常精子受精后的胚胎出现甲基化印记异常的原因可能与体外培养条件有关,也有可能与卵子质量本身有关.

不同类型精子缺陷与印记基因H19甲基化水平关联性研究

目的：探讨不同类型精子缺陷与印记基因H19印记控制区域甲基化水平的相关性。方法：以2014年4月至2014年9月间入院诊治的男性不育患者为研究对象,排除患有精索静脉曲张、隐睾症、核型异常和Y染色体微缺失的病例,依据临床精液常规检查结果,分别筛选出特发性少精子症患者（浓度〈20×10^6/mL,其余指标均正常）、特发性弱精子症患者（前向运动精子百分率〈50%,其余指标均正常）、特发性畸形精子症患者（正常精子形态比率〈15%,其余指标均正常）各25例;25例正常精液样本作为对照组。采用焦磷酸测序法定量分析各组精子DNA中H19基因印记控制区域的甲基化水平。结果：少精子症组[（75.04±15.35）%]和弱精子症组[（79.48±11.64）%]印记基因H19甲基化水平显著低于正常对照组[（89.10±11.23）%],差异均有统计学意义（P=0.006,P=0.024）;畸形精子症组[（87.82±12.10）%]与正常对照组H19基因甲基化水平的差异无统计学意义（P=0.758）。结论：印记基因H19印记控制区域的DNA甲基化程度的降低与少精子症和弱精子症有关联,可能与畸形精子症无关。

印记基因H19单核苷酸多态性与不明原因复发性流产的相关性研究

目的:探讨印记基因H19单核苷酸多态性(SNP)与不明原因复发性流产(URSA)发生的相关性。方法:随机选取2010年1月至2021年3月本院34例不明原因复发性流产患者绒毛组织和42例正常流产患者的绒毛组织为研究对象,提取研究对象基因组DNA,SNP测序分析URSA组与对照组患者H19多个SNP位点的差异,分析单核苷酸多态性与疾病的关系。结果:URSA组和对照组的H19基因rs217727位点基因型、等位基因的分布情况差异有统计学意义(p 0.05)。结论:H19基因rs217727位点单核苷酸多态性可能与URSA相关。

冷冻胚胎印记基因H19的DNA甲基化状态研究

目的:比较研究常规慢速冷冻和玻璃化冷冻后的人类早期胚胎印记基因H19的DNA甲基化状态,初步了解低温冷冻对胚胎基因印记的影响。方法:收集胚胎移植术后正常受精的低质量的第3天胚胎152个,进行冷冻、复苏,其中常规慢速冷冻胚胎78个,玻璃化冷冻胚胎74个,另收集70个新鲜未冷冻胚胎作为对照;记录3种类型单个胚胎Bisulfite-PCR扩增个数,采用结合重亚硫酸盐限制性酶分析法检测胚胎印记基因H19的DNA甲基化状态。结果:慢速冷冻胚胎、玻璃化冷冻胚胎及新鲜未冷冻胚胎的单个胚胎Bisulfite-PCR扩增分别成功40、53、58个;慢速冷冻胚胎、玻璃化冷冻胚胎及新鲜未冷冻胚胎H19基因的平均甲基化程度分别为(44.8±6.4)%、(47.5±5.6)%及(46.7±6.0)%,异常甲基化率分别为10.0%(4/40)、13.2%(7/53)及3.4%(2/58);3组胚胎的甲基化程度和异常甲基化率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:低温冷冻不增加人类胚胎甲基化异常的发生率。

大鼠骨缺损愈合里骨痂的形成过程中H19的表达情况

研究目的：通过检测H19在骨损伤之后愈合过程中的表达变化探讨骨损失愈合的相关细胞和H19的关系。研究方法：大鼠左后肢股骨做骨缺损造模，右后肢股骨做假手术处理。于5d、10d、15d、20d、25d断颈法处死。实时荧光定量PCRN0定Ill9表达。研究结果：在5d到25d中，H19在损伤组和对照组均有表达；损伤后5d，实验组H19的表达量是对照组的两倍；损伤后lOd，实验组H19的表达量是对照组的两倍；损伤后15d、20d、25d，实验组H19的表达量和对照组H19的表达量基本持平。研究结论：H19促进骨细胞的增殖与分化，可加速骨损伤的愈合。。

长链非编码RNA 91H对食管鳞癌组织中IGF2表达的调控作用及机制研究

目的探索长链非编码RNA(lncRNA)91H对食管鳞癌(ESCC)组织中胰岛素样生长因子2(IGF2)异常表达的调控机制,评价其在ESCC发生、发展中的作用。方法收集232例ESCC患者癌组织和癌旁组织标本以及食管鳞癌细胞系TE-1和Eca-109,用实时荧光定量PCR及免疫荧光法检测其91H和IGF2的表达水平,亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP)检测印记基因H19调控区域(ICR)的甲基化程度。结果肿瘤患者浸润程度越深、肿瘤等级和TNM分期越高,91H的表达量越低而IGF2表达量越高(P<0.05),用91H RNA干扰后,TE-1细胞IGF2 mRNA的表达水平为4.91±1.68,明显高于阴性对照组1.38±0.61(P<0.05);Eca-109细胞IGF2 mRNA的表达水平为3.62±1.44,明显高于阴性对照组1.75±1.00(P<0.05);经5-aza-CdR去甲基化处理后,细胞甲基化程度越低,91H表达水平越高(P<0.05)。结论 lncRNA 91H的表达与H19 ICR区甲基化程度密切相关,其对IGF2表达起抑制作用,提示lncRNA 91H可作为一个新的遗传学标志物。

孕期慢性应激对子代雌性大鼠抑郁样行为及印记基因IGF-2/H19甲基化的影响

目的探究孕期慢性应激对子代雌性大鼠抑郁行为及海马组织印记基因胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor-2,IGF-2)/长链非编码RNA(lncRNA)H19甲基化的影响。方法32只SPF级雌性SD大鼠按照随机数字表法分为模型组和对照组,模型组大鼠采用慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress model,CUMS)方法建立抑郁模型,对照组正常饲养。应激刺激第7天时,雌雄鼠合笼交配。在应激刺激前1 d和应激刺激第1、7、14、21、28天对两组母鼠行内眦静脉采血,测定血浆皮质酮浓度;在雌性仔鼠出生后第28天和出生后第42天时,每组随机抽取8只,行内眦静脉采血后测定血浆皮质酮浓度;在出生后第42天时,分别通过糖水偏爱实验、悬尾实验和强迫游泳实验测定两组雌性仔鼠的抑郁样行为。采用RT-PCR和Western blot法检测仔鼠海马组织中IGF-2/H19及相关转移酶表达情况。利用Methyl Target技术,对IGF-2差异性甲基化区域(differentially methylated region,DMR)片段2的19个CpG位点,H19印记控制区(imprinting control region,ICR)片段1中8个CpG位点和H19-ICR片段2的15个CpG位点,同时捕获测序,计算每个CpG位点甲基化水平。采用SPSS 26.0,采用重复测量方差分析、t检验和非参数检验对相关数据进行统计分析。结果(1)重复测量方差分析结果显示,母鼠血浆皮质酮的时间与组别的交互效应不显著(F=2.997,P=0.066),时间主效应显著(F=4.44,P=0.010),组别主效应显著(F=41.40,P=0.001)。组间因素的单独效应分析,在应激第14、21、28天,模型组母鼠血浆皮质酮浓度均高于对照组母鼠(均P<0.001)。(2)在糖水偏爱实验中,模型组雌性仔鼠的液体总消耗[11.10(10.38,11.58)mL,13.55(12.00,15.77)mL,Z=-3.055,P=0.002]、1%蔗糖水消耗[(5.50±1.30)mL,(8.56±2.04)mL,t=-3.582,P=0.003]及1%蔗糖偏爱百分比[(51.35±8.69)%,(62.11±8.05)%,t=-2.576,P=0.022]均低于对照组。(3)模型组雌性仔鼠悬尾实验中静止持续时间[(126.95±39.89)s,(54.30±25.00)s,t=4.375,P=0.001]和强迫游泳实验中持续不动时间[(7.97±6.66)s,(1.85±2.12)s,t=2.478,P=0.037]均长于对照组。(4)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 mRNA[(0.46±0.24),(1.00±0.00),t=3.821,P=0.019]、H19 mRNA[(0.60±0.25),(1.00±0.00),t=3.574,P=0.007]表达均低于对照组;模型组雌性仔鼠IGF-2蛋白相对表达低于对照组[(0.77±0.04),(1.00±0.00);t=9.876,P=0.01);CCTC结合因子(CCTC-binding factor,CTCF)的mRNA[(1.29±0.12),(1.00±0.00),t=-4.850,P=0.003]和蛋白相对表达水平[(1.90±0.28),(1.00±0.00),t=-5.513,P=0.005]均高于对照组。(5)模型组雌性仔鼠海马组织IGF-2 DMR区域3个CpG位点甲基化水平均低于对照组(t=-3.21,-3.00,-3.34,均P<0.05),分别位于chr1215831028、chr1215831055和chr1215831205;IGF-2 DMR片段甲基化水平低于对照组(t=-3.453,P=0.048);模型组雌性仔鼠甲基转移酶DNMT3A mRNA(t=5.102,P=0.002)、DNMT3A(t=10.213,P<0.001)和DNMT3B(t=4.169,P=0.014)蛋白相对表达水平均低于对照组。结论孕期慢性应激致雌性仔鼠出现抑郁、绝望状态,其机制可能与甲基化转移酶表达降低引起印记基因IGF-2 DMR甲基化水平降低有关。